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    高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中的4種雌激素

    2013-12-31 00:00:00余曉翟海云林海丹招春華盧綺雯潘育方
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年12期

    摘要:采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中的4種雌激素(雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚)。檢測(cè)條件為色譜柱Kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相甲醇-水(60∶40,V/V),流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm,柱溫25 ℃。結(jié)果表明,4種雌激素成分在0.02~200 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系。樣品平均加標(biāo)回收率為92.4%~109.3%,RSD為2.4%~3.4%,飼料中4種雌激素的檢出限為0.010~0.030 mg/kg。該法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高,可同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物飼料中4種雌激素含量。

    關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;雌激素;動(dòng)物飼料

    中圖分類號(hào):O657.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2013)12-2907-02

    Determination of Four Estrogens in Animal Feeds by HPLC

    YU Xiao1,ZHAI Hai-yun1,LIN Hai-dan2,ZHAO Chun-hua1,LU Qi-wen1,PAN Yu-fang1

    (1. Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,China;

    2. Guangdong Institute of Veterinary Drug and Feedstuffs Control, Guangzhou 510230,China)

    Abstract: The simultaneous determination method of four estrogen (estrone, estriol, ethiny, diethylstilbestrol) in animal feeds were established by RP-HPLC with Kromasil C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm) column at 25 ℃. The mobile phase consisted of methanol-water (60∶40,V/V). The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 279 nm. The results revealed that there were good linear responses in the range of 0.02~200 μg/mL of 4 estrogens, and LODs were 0.010~0.030 mg/kg. The average recoveries were 92.4%~109.3% with RSD of 2.4%~3.4%. Consequently, the method was simple, sensitive for quality control of these estrogens in animal feeds.

    Key words: HPLC; estrogen; animal feeds

    飼料安全是動(dòng)物性食品安全的重要環(huán)節(jié),近年來(lái),由飼料安全問(wèn)題引發(fā)的食品安全事件時(shí)有發(fā)生。在飼料和動(dòng)物飲用水中非法添加的雌激素能促進(jìn)機(jī)體的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。雌激素在動(dòng)物體內(nèi)一般難以降解,人食用后可在人體內(nèi)(主要是內(nèi)臟、血液中)積累,擾亂內(nèi)源雌激素的正常作用,誘發(fā)癌癥、早熟、女性男性化和男性女性化等癥狀,其毒性還可通過(guò)母體胎盤和母乳傳給后代,對(duì)人類健康危害極大[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)文件明確禁止在動(dòng)物飼料和飲用水中添加雌激素。目前激素分析技術(shù)主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2]、高效液相色譜法[3,4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5,6]等。本試驗(yàn)建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定動(dòng)物飼料中4種雌激素(雌酮、雌三醇、炔雌醇、己烯雌酚)的方法,該方法將為動(dòng)物飼料中上述4種雌激素的檢測(cè)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    市售雞、豬、蝦、魚配合飼料。

    1.2 試劑與儀器

    色譜純甲醇,購(gòu)于Dima公司;去離子水;其余試劑均為分析純。雌三醇對(duì)照品(批號(hào)100935-200701)、炔雌醇對(duì)照品(批號(hào)100052-200308)、雌酮對(duì)照品(批號(hào)100849-200501)、己烯雌酚對(duì)照品(批號(hào)100033-200607)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

    高效液相色譜儀(LC-10ATvp型輸液泵,SCL-10Avp型控制器,二極管陣列檢測(cè)器,LC Solution色譜工作站,日本島津)、超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)、離心機(jī)(鞏義市予華儀器有限公司)、數(shù)控恒溫水浴鍋(北京康林科技有限責(zé)任公司)、電子分析天平、0.45 μm微孔濾膜及配套注射器。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相:甲醇-水(60∶40,V/V),流速:1 mL/min,柱溫:25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):279 nm,進(jìn)樣量:20 μL。樣品測(cè)定采用色譜峰的保留時(shí)間定性,并以紫外吸收光譜圖輔助定性,外標(biāo)法峰面積定量。

    1.3.2 對(duì)照品和供試品溶液的制備 分別稱取雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚對(duì)照品各1 mg,用甲醇溶解并定容至1 mL,配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液到5 mL容量瓶中,用甲醇定容,配成濃度為0.02~200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取飼料樣品1.000 g于10 mL離心管中,加入9 mL甲醇,超聲波處理60 min,離心,移取上層清液至另一支10 mL離心管,氮?dú)獯蹈?;加? mL甲醇,超聲波溶解5 min后轉(zhuǎn)至5 mL離心管,并用1 mL甲醇洗滌原離心管,合并于5 mL離心管中,氮?dú)獯蹈?;? mL甲醇超聲波溶解殘?jiān)? min,溶液經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,濾液待測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色譜條件

    在上述色譜條件下4種對(duì)照品的色譜圖見圖1。

    2.2 方法評(píng)價(jià)

    2.2.1 線性關(guān)系及檢出限 在設(shè)定色譜條件下,標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為0.02~200 μg/mL,分別取20 μL進(jìn)行HPLC分析。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明4種雌激素均在0.02~200 μg/mL范圍內(nèi)波度與峰面積線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)大于0.999 9,各標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和檢出限(s/n=3)如表1所示。

    2.2.2 精密度試驗(yàn) 用濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次,分別測(cè)定4種雌激素的峰面積,并計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%~3.3%。

    2.2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取不同種類的不含雌激素的飼料樣品1.000 g,平行6份,分別添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分混勻后按照“1.3.2”制備供試品溶液,按色譜條件測(cè)定,結(jié)果見表2。雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚的平均加標(biāo)回收率分別為92.4%~99.3%、102.8%~109.3%、90.5%~95.7%和100.6%~107.8%,平均RSD分別為3.0%、2.7%、2.4和3.4%。

    2.3 樣品分析

    按本方法對(duì)市售動(dòng)物飼料樣品進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見圖2。以保留時(shí)間和檢出峰的光譜圖定性分析,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,雞、豬、蝦和魚配合飼料中均檢出含有雌三醇,含量分別為1.11、1.87、0.919和3.13 mg/kg,但未檢出雌酮、炔雌醇和己烯雌酚。另外,從圖2可見,樣品經(jīng)前處理后,各飼料基質(zhì)對(duì)雌激素的檢出無(wú)干擾。

    3 小結(jié)

    在預(yù)試驗(yàn)中比較了不同配比甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相體系對(duì)各雌激素分離以及飼料基質(zhì)干擾的影響,結(jié)果表明,在60∶40體積比的甲醇-水流動(dòng)相條件下,4種雌激素分離良好,飼料中基質(zhì)成分不干擾測(cè)定。采用二極管陣列紫外檢測(cè)器對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),可通過(guò)保留時(shí)間和檢出峰的光譜圖進(jìn)行雌激素的定性分析,避免了普通紫外檢測(cè)器的假陽(yáng)性結(jié)果。由于本試驗(yàn)所用的幾種動(dòng)物飼料中均檢出雌三醇,故提示相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)食用動(dòng)物飼料中相關(guān)雌激素的管理和監(jiān)督。

    參考文獻(xiàn):

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