5—aza—dc對(duì)延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

摘要：通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc對(duì)延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行不同處理后，利用MTT比色法選定5-aza-dc的最適作用濃度和時(shí)間，用Hochest33342/PI雙染和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，通過核型分析檢測(cè)5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響。結(jié)果表明，低濃度的5-aza-dc（≤0.010 μmol/L）作用72 h對(duì)細(xì)胞影響不大；隨其濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)、活率、凋亡及染色體都受到顯著影響。5-aza-dc對(duì)細(xì)胞的最佳處理時(shí)間為72 h，此時(shí)低濃度的5-aza-dc并未引起細(xì)胞凋亡和核型改變。

關(guān)鍵詞：5-aza-dc；延邊奶山羊；細(xì)胞活率；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）12-2862-04

Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell

CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，F(xiàn)NAG Nan-zhu，LI Zhong-shu

（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.

Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis

體細(xì)胞核移植是哺乳動(dòng)物胚胎工程的主要組成部分，也一直是研究的熱點(diǎn)。然而核移植研究中仍然存在著許多問題，如核移植效率低、胚胎發(fā)育異常、流產(chǎn)、畸形等。大量研究表明，體細(xì)胞核移植所用的供體細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等）都是高度分化的細(xì)胞，具有較高的甲基化水平，在與受體細(xì)胞融合時(shí)需要經(jīng)過去甲基化才能維持胚胎正常發(fā)育，如果重構(gòu)胚基因組DNA的甲基化模式存在異常，可引起特定基因轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生改變，從而導(dǎo)致重構(gòu)胚發(fā)育異常。因此，有必要尋找一種降低DNA甲基化水平，進(jìn)而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為正常胞嘧啶核苷的類似物。在細(xì)胞內(nèi)這種核苷類似物可以轉(zhuǎn)化為脫氧核苷三磷酸，并在DNA復(fù)制的過程中替代正常的胞嘧啶核苷酸參與到延伸的DNA鏈中，一旦進(jìn)入DNA雙鏈后，它們所含有的修飾堿基——5-氮胞嘧啶可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合，使酶的活性降低，最終使處理細(xì)胞基因組DNA發(fā)生去甲基化；有研究表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理牛供體細(xì)胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金輝[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）處理水牛成纖維細(xì)胞，顯著降低了供體細(xì)胞的甲基化水平并提高了隨后核移植的效率。延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞作為延邊奶山羊體細(xì)胞克隆的核供體有重要的研究意義。因此，本研究旨在探討5-aza-dc對(duì)延邊奶山羊體細(xì)胞克隆供體細(xì)胞的影響，為提高延邊奶山羊體細(xì)胞克隆效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO預(yù)融，超純水配制成0.25 mg/mL的濃縮液備用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基礎(chǔ)藥類均購自SIGMA中國有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取試劑盒購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 材料 延邊奶山羊耳部組織塊。剪取奶山羊（母）耳部血管較少處組織，大約1.5×2.0 cm2。用PBS沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS沖洗3次，最后將組織塊剪碎。經(jīng)過3～5次PBS及胰蛋白酶洗滌后，均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液[4]。每3～5 d換液1次。當(dāng)原代細(xì)胞匯合至80%時(shí)，消化傳代，3代以后的成纖維細(xì)胞可用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞 取3代以上的延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞，消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，接種于24孔或96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)。5-aza-dc的濃度設(shè)定為0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。

1.2.2 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞活率的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各處理成纖維細(xì)胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)反應(yīng)儀測(cè)492 nm處的OD值。

1.2.3 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響 不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，換液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化懸浮細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，37 ℃預(yù)溫的0.075 mol/L KCl低滲處理30 min后，用新鮮固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定細(xì)胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液懸浮細(xì)胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油鏡觀察[5]。每組處理選取一定數(shù)量的清晰分裂相，記錄變異的染色體數(shù)目。

1.2.5 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

1）Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342熒光染色，37 ℃避光孵育10 min，離心去上清，用培養(yǎng)液懸浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察[6]。

2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，消化收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，500 μL PBS懸浮細(xì)胞后，按DNA提取試劑盒步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞活率的影響

由表1可知，不同濃度的5-aza-dc分別培養(yǎng)延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞24、48、72、96 h后的細(xì)胞活率，比較可知72 h組效果較好，且與48 h、96 h組差異不顯著，因此后續(xù)試驗(yàn)中細(xì)胞均處理72 h。

2.2 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖1可知，未經(jīng)5-aza-dc處理的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，接觸緊密，細(xì)胞大小均一，生長速度較快。而經(jīng)過5-aza-dc處理后的細(xì)胞隨著5-aza-dc濃度的升高，細(xì)胞變得細(xì)長，生長緩慢，細(xì)胞間隙增大，形態(tài)不規(guī)則，甚至有的地方細(xì)胞大片脫壁死亡。

2.3 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響

采用常規(guī)核型分析方法，分析不同濃度的5-aza-dc處理的延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞，每個(gè)處理組選取50個(gè)分散較好的清晰分裂相，統(tǒng)計(jì)畸變?nèi)旧w概率。由圖2可知，當(dāng)濃度≤0.010 μmol/L時(shí)，染色體畸變率對(duì)照組與其他兩組差異不顯著；當(dāng)濃度≥0.030 μmol/L時(shí)染色體畸變率顯著增加，出現(xiàn)多倍體（圖3）。當(dāng)濃度達(dá)到0.1 μmol/L時(shí)，染色體畸變率達(dá)到12%。

2.4 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Hochest33342/PI雙染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色、弱紅色熒光，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色，而正常的細(xì)胞則呈弱藍(lán)色熒光。當(dāng)濃度為0、0.005、0.010 μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞較少；濃度≥0.030 μmol/L時(shí)出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞；濃度為0.100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，死細(xì)胞數(shù)目也增多。如圖4所示。

2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 由圖5可知，當(dāng)濃度≤0.010 μmol/L時(shí)，細(xì)胞無拖帶現(xiàn)象，說明無凋亡細(xì)胞；濃度≥0.030 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，說明出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；濃度為0.050、0.100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞大量凋亡，拖帶現(xiàn)象明顯。

3 討論

3.1 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞活率、細(xì)胞形態(tài)的影響

5-aza-dc是一種典型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc處理第五代豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF），發(fā)現(xiàn)不同濃度的5-aza-dc均抑制PFF的生長，較高濃度的5-aza-dc處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和染色體的倍性發(fā)生改變。Enright等[8]對(duì)供體成纖維細(xì)胞進(jìn)行5-aza-dc處理后發(fā)現(xiàn)高劑量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低細(xì)胞甲基化水平，其研究也發(fā)現(xiàn)5-aza-dc處理72 h為最佳處理時(shí)間。鑒于5-aza-dc對(duì)細(xì)胞的毒性作用，本試驗(yàn)采用較低濃度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明，經(jīng)5-aza-dc處理后的細(xì)胞生長速度、形態(tài)等與對(duì)照組相比無明顯差異，說明延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞對(duì)5-aza-dc具有較強(qiáng)的耐受性。但是隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞形態(tài)改變、死亡數(shù)增多，逐漸出現(xiàn)脫壁等現(xiàn)象，這可能是與5-aza-dc對(duì)細(xì)胞的毒性有關(guān)。這與Kumar等[7]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響

有研究證明，供體細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境以及藥物等處理會(huì)導(dǎo)致其染色體異常，進(jìn)而引起隨后NT胚胎染色體異常，說明在核移植前首先檢查供體細(xì)胞的染色體還是必要的[9]。本試驗(yàn)使用常規(guī)染色體核型分析方法，即經(jīng)低滲、固定、Giemsa染色等步驟后，滴片制備染色體標(biāo)本。結(jié)果表明，高濃度的5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體有致畸作用，濃度越高染色體出現(xiàn)異常的幾率越大；而低濃度（≤0.010 μmol/L）對(duì)染色體影響不大。通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證高濃度的5-aza-dc對(duì)染色體的影響，可見明顯的拖帶現(xiàn)象，分析原因可能是染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如斷裂等。

3.3 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

PI、Hochest33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細(xì)胞膜，Hochest33342則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期凋亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。本研究用5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞72 h后，觀察不同的濃度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，采用Hochest33342和PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色、弱紅色熒光，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色，而正常的細(xì)胞則呈弱藍(lán)色熒光。正常細(xì)胞和中早期凋亡細(xì)胞均可被Hochest33342著色，但是正常細(xì)胞核的Hochest33342著色的形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒；而凋亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮藍(lán)色，或核呈分葉，碎片狀。細(xì)胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內(nèi)源性核酸酶的激活，細(xì)胞核染色體從核小體間斷裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。針對(duì)這些片段應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。凋亡細(xì)胞呈明顯的梯狀條帶。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，0～0.010 μmol/L幾組都沒有出現(xiàn)明顯的拖帶現(xiàn)象，而從0.030 μmol/L組就開始有拖帶現(xiàn)象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L濃度組與對(duì)照組相比細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著增加。此結(jié)果進(jìn)一步證明高濃度的5-aza-dc可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

5-aza-dc處理延邊奶山羊成纖維細(xì)胞適宜時(shí)間為72 h，隨著5-aza-dc處理濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)有所改變，接觸不緊密。當(dāng)濃度升高到0.100 μmol/L時(shí)大片細(xì)胞脫壁死亡；當(dāng)濃度≥0.030 μmol/L時(shí)，染色體畸變率顯著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L組對(duì)染色體核型的影響與對(duì)照組相比差異不顯著；瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)經(jīng)5-aza-dc處理的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明高濃度的5-aza-dc可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，低濃度的5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響較小。以上說明高濃度的5-aza-dc對(duì)細(xì)胞有一定毒性作用，但是低濃度對(duì)細(xì)胞影響較小，可以應(yīng)用低濃度的5-aza-dc作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體成纖維細(xì)胞，嘗試建立一種既不影響成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性，又可以降低供體細(xì)胞核的甲基化狀態(tài)的方法，從而提供一種提高體細(xì)胞核移植效率的方法。

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