努魯爾虎山東部北麓敖漢旗段豆科植物根瘤菌資源調(diào)查

摘要：通過對努魯爾虎山東部北麓部分地區(qū)豆科植物根瘤菌資源調(diào)查，共采集到根瘤樣品326份，包括野生和栽培豆科植物13屬21種。分析結(jié)果表明，采集的豆科植物根瘤大多數(shù)著生在側(cè)根或須根上，根瘤的形狀主要有棒狀、球狀、掌狀，少數(shù)珊瑚狀、三棱狀；顏色多為土黃色、棕色、粉色，少數(shù)呈白色或綠色。豆科植物與根瘤菌共生結(jié)瘤及根瘤特征除了與寄主植物的遺傳特性、發(fā)育時期有關(guān)外，還與其所處的生態(tài)環(huán)境（水分、溫度、土壤結(jié)構(gòu)、土壤pH等）有密切的關(guān)系。抗逆性試驗結(jié)果表明，根瘤菌對NaCl、pH、重金屬Hg2+、Cu2+、Pb2+等具有較強的抗逆性，與豆科植物生長的地理環(huán)境有直接的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：豆科植物；根瘤菌；根瘤特征；生態(tài)環(huán)境；抗逆性；努魯爾虎山

中圖分類號：Q949.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2747-04

Investigation of Rhizobial Resources of Leguminous Plants in Aohan County of North Foot of Eastern Nuluerhu Mountain

XU Ya-jun1，ZHAO Long-fei1，XU Guo-xue2

（1.College of Life Science/Engineering Technology Research Center of Biomass Degradation and Gasification，Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000，Henan，China；2. Jinchanggouliang Town Government of Inner Mongolia Chifeng City，Chifeng 024300，Inner Mongolia， China）

Abstract： The study was conducted to invest the rhizobial resources of leguminous plants in Aohan county of north foot of eastern Nuluerhu mountain. The total numbers of 326 root nodule samples were collected， which were from 13 genera， 21 species of cultivated and wild leguminous plants. These nodules mainly distributed on the lateral root and fibre， the main shapes of them were claviform， spherical， palmated and few coralliform and sparganii， most color of them were soil yellow， brown and pink， the few was white or green. Besides related to the genetic characteristics and development period of host plants， the legume symbiosis nodulation with rhizobia and nodule characteristics were close relation to its ecological environment， including moisture， temperature， soil structure， soil pH， etc. The experimental results about resistance showed that strong resistance of rhizobia to NaCl， pH， heavy metals ions of Hg2+， Cu2+， and Pb2+ had direct connection with the geographic environment of legumes.

Key words： leguminous plant； rhizobia； root nodule characteristics； ecological environment； resistance； Nuluerhu mountain

共生體系是豆科植物與根瘤菌形成的生物固氮體系之一，具有最強的固氮能力，所固定的氮占整個生物固氮總量的65%，相當于全世界工業(yè)合成氮肥量的2倍，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)中起著極其重要的作用。豆科是被子植物中的大科，在全世界有約750屬近2萬種，我國約有150屬1 500多種。但這2萬多種豆科植物中，進行過結(jié)瘤調(diào)查的尚不足16%[1]。努魯爾虎山東段位于遼寧省和內(nèi)蒙古自治區(qū)接界處，東北西南走向，海拔均在1 000 m以上，敖漢旗段屬大陸性季風氣候，年降雨量310～460 mm，年平均氣溫為5～7 ℃。地下分布著豐富的礦產(chǎn)資源，但嚴重頻繁的自然災害制約著農(nóng)牧林業(yè)的發(fā)展。受地形、氣候、土壤結(jié)構(gòu)等綜合因素的影響[2]，生長著大量野生或栽培豆科植物，如草本豆科植物黃芪、棘豆、高山豆、胡枝子等，木本豆科植物如紫穗槐、檸條兒等，它們在這種惡劣生態(tài)環(huán)境中能夠頑強生長，一般都具有較強的抗干旱、耐鹽堿、耐重金屬等優(yōu)良特性，且為這種環(huán)境中的先鋒植物，為該地區(qū)的土壤體系提供了氮源。所以在防風固沙、生態(tài)恢復、保持水土、綠化環(huán)境等方面起著很重要的作用。為此，對努魯爾虎山東部北麓敖漢旗段的豆科植物根瘤菌資源進行調(diào)查，可為根瘤菌種質(zhì)資源的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查路線

調(diào)查于2011年7-8月份進行，選擇努魯爾虎山東部北麓典型生態(tài)區(qū)域進行豆科植物根瘤資源調(diào)查，敖漢旗內(nèi)的調(diào)查地點包括林家地鄉(xiāng)鎮(zhèn)、四家子鎮(zhèn)、貝子府鎮(zhèn)、金廠溝梁鎮(zhèn)等。

1.2 根瘤標本的采集

對每種豆科植物隨機挖取植株，選取新鮮、飽滿的根瘤，放入盛有變色硅膠的離心管，密封并按采集順序編號，每株植物上的根瘤裝在一管中。記錄植物名、結(jié)瘤情況，包括是否結(jié)瘤、根系類型、根瘤大小、根瘤顏色、根瘤形狀、著生部位。同時記錄生態(tài)環(huán)境，包括采集時間、地點、經(jīng)緯度、海拔、土壤類型、地形地貌、植物生長階段、生境、伴生植物生態(tài)、土地使用情況等。

1.3 根瘤菌的分離與純化

對采集的干燥根瘤，先在無菌水中浸泡3～4 h至根瘤充分吸脹，經(jīng)無水乙醇處理20 s，3%的次氯酸鈉滅菌5 min，用無菌水沖洗8～10次，在無菌條件下用鑷子將根瘤壓碎，擠出汁液，涂布于YMA培養(yǎng)基平皿上，置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)。采用稀釋平板劃線法，挑取單菌落，進行染色、鏡檢，并接入試管斜面中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 根瘤菌理化特性的測定

對分離的菌株進行理化特性試驗，主要包括耐鹽性測定（NaCl 4%、5%、6%、7%、8%）、溫度（4、10、28、40、60 ℃）、重金屬（Hg2+、Cu2+、Pb2+）抗性等特性的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)瘤豆科植物資源調(diào)查結(jié)果

此次調(diào)查共采集到根瘤樣品326份，包括野生和栽培豆科植物13屬21種。從表1可以看出，采集到的豆科植物以菜豆屬、苜蓿屬、黃芪屬、野豌豆屬、胡枝子屬為多，其中苜蓿屬有天藍苜蓿、紫花苜蓿、黃花苜蓿等3種；胡枝子屬有胡枝子、達里胡枝子、截葉鐵掃帚等3種，這些豆科植物中，除少數(shù)高山豆、甘草采集到較少根瘤外，其他豆科植物都能夠結(jié)瘤。

2.2 結(jié)瘤豆科植物的根瘤特征分析

對采集到的13屬21種豆科植物根瘤的著生部位、形狀、大小、顏色進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)根瘤著生在側(cè)根或須根上，多數(shù)是草本、野生、栽培一年生和木本多年生豆科植物。如菜豆屬的菜豆和綠豆根瘤著生以須根為主；苜蓿屬的紫花苜蓿和野苜蓿，胡枝子屬的胡枝子、達里胡枝子、截葉鐵掃帚的根瘤主要著生在須根上；紫穗槐屬、刺槐屬、棘豆屬、野豌豆屬中的三齒野豌豆、蠶豆根瘤也主要著生在須根和側(cè)根上；黃芪屬、豇豆屬、錦雞兒屬、甘草屬、高山豆屬的根瘤多數(shù)著生在須根上。而苜蓿屬的天藍苜蓿、大豆屬的野大豆的大豆根瘤主要著生在主根上，少數(shù)為須根（表1）。

由表1可見，根瘤形狀呈現(xiàn)多樣性，主要有棒狀、球狀、掌狀，少數(shù)呈珊瑚狀、三棱形、掌狀。如苜蓿屬的野苜蓿，黃芪屬的2種，錦雞兒屬的檸條兒，甘草屬的甘草，高山豆屬的高山豆，它們的根瘤呈現(xiàn)棒狀；野豌豆屬的三齒野豌豆和蠶豆的根瘤呈現(xiàn)掌狀、棒狀；菜豆屬的菜豆、綠豆，胡枝子屬的3種，紫穗槐屬紫穗槐，大豆屬的大豆和野大豆，豇豆屬的豇豆，它們的根瘤都呈現(xiàn)球狀；棘豆屬的棘豆根瘤呈現(xiàn)掌狀、扁平狀；刺槐屬的刺槐根瘤呈現(xiàn)珊瑚狀、不規(guī)則狀，苜蓿屬的天藍苜蓿根瘤呈扁球形、三棱形，紫花苜蓿根瘤呈鐘狀、掌狀。以上分析表明，根瘤形態(tài)的多樣化主要與植物有關(guān)，同屬不同種的豆科植物根瘤形態(tài)往往是相似的。當根瘤菌侵染寄主時，寄主植物缺乏感染線或感染線分支不廣，缺乏永久分生組織，則根瘤多呈圓形；當類菌體通過感染線感染寄主，而寄主植物具有永久分生組織，根瘤通常無限生長，一般呈棒狀；當植物感染線在一個平面上有多個分支，根瘤多形成掌狀，感染線分支較廣，就會形成珊瑚狀的根瘤?？梢?，豆科植物根瘤形態(tài)涉及到宿主植物的遺傳因子而與根瘤菌種類關(guān)系不大[3]。

從根瘤的大小來看，所調(diào)查的13屬豆科植物中，多數(shù)根瘤大小在1～3 mm，而刺槐屬刺槐、棘豆屬的棘豆、大豆屬的大豆根瘤相對稍大，最大可達6 mm。藺繼尚等[4]研究表明，根瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)受到當?shù)亻L期干旱環(huán)境的影響，根瘤皮層明顯比非干旱區(qū)豆科植物根瘤皮層厚。相對厚的皮層為根瘤中心區(qū)內(nèi)的類菌體提供了一個適應(yīng)范圍較大的氣體擴散屏障。表明根瘤皮層結(jié)構(gòu)的改變足以抵御外界干旱的氣候條件。

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)根瘤的顏色多數(shù)呈土黃色、棕色、粉紅色，少數(shù)為白色、綠色，這與寄主植物所處的發(fā)育期有一定的關(guān)系。如處于花期、果期的根瘤多呈飽滿的粉紅色、土黃色，少數(shù)呈白色和褐色。根瘤呈粉紅色、黃色為有效瘤，由于豆血紅蛋白的存在使根瘤呈粉紅色，皮層較厚的根瘤呈現(xiàn)黃色，具有固氮酶活性，豆血紅蛋白向類菌體提供低濃度和高流量的氧，是進行固氮作用的必備條件之一。而呈白色、綠色的根瘤屬于無效瘤，顏色較深的根瘤是處于固氮的后期，顏色會逐漸變深，呈綠色、黑色，逐漸衰老，直至死亡、干癟。

綜上所述，豆科植物屬間根瘤的特性差異較大，同屬種間根瘤特性近似，表明根瘤的特征與宿主植物本身的遺傳特性有一定的關(guān)系[5]。在努魯爾虎山東部北麓常年多干旱少雨的氣候條件下，豆科植物生態(tài)習性比較多樣化，根瘤所呈現(xiàn)特點是豆科植物及其共生固氮適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。

2.3 生態(tài)環(huán)境對豆科植物結(jié)瘤特性的影響

根瘤菌侵染豆科植物形成根瘤是一個非常復雜的過程，經(jīng)歷根瘤菌對豆科植物根際互相識別、根毛彎曲、根瘤菌侵染形成侵入線等過程。影響豆科植物結(jié)瘤及根瘤特征的生態(tài)因素是多方面的，這里主要從水分、溫度、土壤、pH等方面進行探討。

調(diào)查結(jié)果表明，多數(shù)情況下豆科植物根瘤在數(shù)量、有效性方面都與土壤的含水量有密切關(guān)系。如在金廠溝梁鎮(zhèn)上長皋村的北溝附近調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大量的紫花苜蓿和胡枝子植株沒有根瘤，而在大黑山山腳下相對濕潤的河套里發(fā)現(xiàn)結(jié)瘤量較多的野生苜蓿、胡枝子植株，且根瘤多呈粉紅色、土黃色。分析表明，部分原因是由于植株的生長發(fā)育受到土壤含水量的制約，側(cè)根和根毛形成數(shù)目減少，妨礙根瘤菌的入侵，從而大大減少根瘤菌對植物根部浸染的機會。這與賀學禮等[6]的調(diào)查研究相一致，土壤含水量對根瘤的形成和固氮活性有較大的影響。

一般認為，溫度低于7 ℃或高于40 ℃時，根瘤菌不能侵染豆科植物，不易形成有效根瘤，根瘤固氮酶不穩(wěn)定，甚至失去活性。敖漢旗地處中溫帶，屬于大陸性季風氣候，冬季寒冷而漫長，夏季短而酷熱，在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，林家地鄉(xiāng)、四家子鎮(zhèn)的高山豆植株生長很多，但是結(jié)瘤的植株很少，且根瘤相對較小，大小為1～2 mm。但后期的研究進一步證實，溫度對根瘤菌多樣性的影響不顯著，王衛(wèi)衛(wèi)等[7]研究也表明溫度對于干旱區(qū)豆科植物根瘤的形成和固氮活性不是限定性因子。

土壤結(jié)構(gòu)是土壤固相顆粒的大小及空間排列的形式，不僅影響植物生長所需的土壤水分和養(yǎng)分的儲量與供應(yīng)能力，而且還左右土壤中氣體交流、熱量平衡、微生物活動及根系的延伸等。土壤結(jié)構(gòu)也直接影響根瘤菌和豆科植物的結(jié)瘤及根瘤特性。如在大黑山山腳下的貝子府鎮(zhèn)采集甘草植株時，發(fā)現(xiàn)該地的土壤是巖石長期風化形成的的褐鈣土，土質(zhì)堅硬、堿性強，所以此地結(jié)瘤的甘草植株較少，且根瘤小，這可能與土壤通氣性差有關(guān)。加之根瘤菌是好氧性微生物，土壤的通氣狀況影響根瘤菌在土壤中的活性和固氮活性。風化的鈣質(zhì)土壤使得土壤呈現(xiàn)堿性，堿性的土壤經(jīng)豆科植物及與其共生的根瘤菌的長期共同進化，形成了耐堿的共生固氮體系。這一點課題組在我國西北地區(qū)豆科植物根瘤資源調(diào)查過程中得到了證實[2]，如甘肅、陜北的多種豆科植物能夠在偏堿的土壤中結(jié)瘤固氮。

2.4 根瘤菌的抗逆性

試驗結(jié)果表明，分離的這些根瘤菌具有較強的抗逆性。326株根瘤菌中88%的菌株在含7%的NaCl YMA固體培養(yǎng)基上能夠生長，有8株菌株甚至能耐受8%的NaCl。有80%的菌株在pH 10的培養(yǎng)基上能夠生長。對重金屬的抗性試驗結(jié)果表明，97%的菌株分別可耐受2 mmol/L的Pb2+，0.05 mmol/L的Hg2+和2.1 mmol/L的Cu2+。這些抗性的獲得可能與豆科植物生長的地理環(huán)境有直接的關(guān)系。努魯爾虎山東部北麓敖漢旗境內(nèi)，分布著豐富的礦產(chǎn)資源，如鐵、金、銅、鎢、鉛、石灰石等礦產(chǎn)，長期的自然選擇，“篩選”出了抗性強的微生物菌株，這為篩選和克隆抗逆基因提供了豐富的微生物資源。

3 討論

1）努魯爾虎山東部位于遼寧省和內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處，屬大陸性季風氣候，年平均氣溫為5～7 ℃，晝夜溫差較大，地形較為復雜，土壤種類繁多，生態(tài)環(huán)境較為惡劣。栽培的豆科植物相對較少，而野生的豆科植物分布較廣。研究發(fā)現(xiàn)分離出的根瘤菌能耐受的溫度范圍較寬，對鹽、pH、重金屬等都有較強的抗性。如廣泛分布的野大豆根瘤菌，98%的菌株可以耐受4～60 ℃ 15 min，之后置于28 ℃下能夠正常生長，并且97%菌株可耐受一定濃度的重金屬Cu2+、Hg2+、Pb2+。這可能是根瘤菌已經(jīng)適應(yīng)這種特殊的氣候和地理環(huán)境，和植物形成共生固氮體系，具有較寬溫度適應(yīng)范圍、較強的抗重金屬特性，這與陳文新等[8]的研究結(jié)果相似。根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的建立是細菌、植物及環(huán)境三方相互作用的結(jié)果，無論是栽培種還是野生種，豆科植物都需要與適應(yīng)當?shù)丨h(huán)境的根瘤菌建立共生關(guān)系。這為選育抗寒、抗重金屬污染、提高環(huán)境固氮率的根瘤菌，開展根瘤菌遺傳多樣性與生態(tài)地理學之間關(guān)系的研究提供了條件。

2）影響豆科植物根瘤特性和能否結(jié)瘤的因素有很多，除土壤水分、結(jié)構(gòu)、pH等因素外，還與土壤中營養(yǎng)元素、土壤微生物、光照、溫度、植物的生育期、土壤含鹽量、地貌特征、農(nóng)藥、化肥、農(nóng)事活動等有關(guān)[7，9-12]，這些因素都會對豆科植物的結(jié)瘤和固氮產(chǎn)生一定的影響，所以在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)并非所有豆科植物都能夠結(jié)瘤，如大黑山前子溝中的胡枝子很少發(fā)現(xiàn)有根瘤，大青山山頂?shù)母呱蕉垢龊苌伲覀€體小等。可能與上述影響因素有關(guān)系，或許采樣的范圍不夠廣泛，采樣時間對有些植物不適宜有關(guān)，因此對影響豆科植物結(jié)瘤的因素還需要進一步研究。

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