流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用及方法舉例

摘 要：流式細(xì)胞術(shù)是一種對處在液流中的細(xì)胞或其它生物微粒逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。自發(fā)明以來，流式細(xì)胞儀已被廣泛應(yīng)用在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，極大地推動著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用。該文闡述了流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用，如細(xì)胞核分析、染色體分析、植物細(xì)胞和染色體分選、染色體文庫構(gòu)建、逆境生物學(xué)及育種學(xué)等等，并對應(yīng)用實(shí)例進(jìn)一步進(jìn)行了說明，為流式細(xì)胞儀在植物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用推廣提供借鑒。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀；植物科學(xué)；應(yīng)用；方法

中圖分類號 Q94 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）11-19-03

流式細(xì)胞儀是一種對處在液流中的細(xì)胞或其它生物微粒逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的儀器。它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)為一體，按照細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)行細(xì)胞的分析和分選 [1-3]。自1974年BD（Becton，Dickinson and Company）公司研制出第一臺商用流式細(xì)胞儀（Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACSTM）以來，該技術(shù)方法又取得了巨大的進(jìn)步，使得流式細(xì)胞儀在生物學(xué)，特別是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，被譽(yù)為“實(shí)驗(yàn)室的CT”。

由于植物細(xì)胞自身的細(xì)胞粘連、具有細(xì)胞壁等特性，使得流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)的應(yīng)用稍稍滯后于血液學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域。目前，流式細(xì)胞儀在植物育種、生長發(fā)育、生理生態(tài)、系統(tǒng)進(jìn)化、分類等領(lǐng)域，分子、細(xì)胞、整體乃至系統(tǒng)生物學(xué)水平等領(lǐng)域[1-6]都得到廣泛應(yīng)用。

1 流式細(xì)胞儀原理

細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸浮液并經(jīng)特定的熒光染料染色后上機(jī)，細(xì)胞懸浮液在儀器壓力下形成流暢不間斷的細(xì)小液流，使這些單個(gè)細(xì)胞一個(gè)一個(gè)依次通過一個(gè)小室，進(jìn)入小室的細(xì)胞被激光激活，在散射一部分激光的同時(shí)，細(xì)胞也發(fā)出熒光，這些散射的光信號和發(fā)射的熒光信號均被收集并進(jìn)行分析[7]。熒光信號通過透鏡、光闌及濾片到達(dá)光電倍增管，儀器將檢測器測得的信號通過分析系統(tǒng)加以顯示記錄。流式細(xì)胞儀的測試結(jié)果是一個(gè)數(shù)據(jù)文件，它是由光信號強(qiáng)度經(jīng)檢測器（硅光電二極管或光電倍增管）轉(zhuǎn)換成電信號輸出，又經(jīng)多道脈沖分析器和模-數(shù)轉(zhuǎn)換，由微處理器編釋成一種數(shù)據(jù)文件，并經(jīng)相連的電腦及配置的軟件系統(tǒng)將數(shù)據(jù)文件以圖形的方式顯示和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（圖1）[7]。

圖1 流式細(xì)胞工作原理

2 流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 植物細(xì)胞核分析 細(xì)胞核是細(xì)胞指令的發(fā)出場所和遺傳物質(zhì)的儲存、加工及傳遞場所。流式細(xì)胞儀在細(xì)胞核分析方面涉及的應(yīng)用范圍頗為廣泛，例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量的分析，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，細(xì)胞周期分析染色體倍性分析等方面[8-12]。

2.2 原生質(zhì)體分析 正如前面所述，由于植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性，流式細(xì)胞儀對植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的研究依賴于其原生質(zhì)體的制備或細(xì)胞核的解離。通過對原生質(zhì)體的分析研究植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能等。通過流式細(xì)胞儀還可以研究原生質(zhì)體產(chǎn)物分選，細(xì)胞融合產(chǎn)物分選，改良作物品種等方面[8-12]。

2.3 植物細(xì)胞染色體分析和染色體文庫構(gòu)建 流式細(xì)胞儀利用熒光染色的方法能夠識別和分揀單個(gè)染色體。分揀的單一的染色體是構(gòu)建染色體專性DNA文庫和基因定位的最好材料，因此流式分揀的染色體的一個(gè)主要用途是構(gòu)建染色體專性文庫，這些染色體文庫可以廣泛應(yīng)用在基因組分析和基因定位克隆中[8-12]。

2.4 植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能研究 流式細(xì)胞儀已廣泛應(yīng)用到植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究中。例如細(xì)胞大小、細(xì)胞粒度、細(xì)胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細(xì)胞周期、RNA含量、蛋白質(zhì)含量、配體及特異抗原的研究中；流式細(xì)胞儀也被廣泛應(yīng)用在諸如細(xì)胞特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、細(xì)胞活性、酶活性、激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能性研究方面。這些應(yīng)用為植物細(xì)胞生物學(xué)的研究提供了強(qiáng)大工具和理論基礎(chǔ)，并不斷豐富其發(fā)展[8-12]。

2.5 植物分類學(xué)和植物系統(tǒng)學(xué)（Plant systematic）研究 植物分類學(xué)和植物系統(tǒng)學(xué)是根據(jù)植物的特征，植物間的親緣關(guān)系、演化的順序，對植物進(jìn)行分類的科學(xué)，并在研究的基礎(chǔ)之上建立和逐步完善植物各級類群的進(jìn)化系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀可在分子水平上對所研究物種待測的多個(gè)分子Marker如DNA、RNA序列等同時(shí)進(jìn)行檢測，然后綜合定性、定量分析，從而對物種進(jìn)行特征、歸類，并為其系統(tǒng)發(fā)育研究提供分子水平上的遺傳證據(jù)[8-12]。

2.6 逆境植物學(xué)和植物病理學(xué)（Plant pathology）研究 植物如何應(yīng)對諸如干旱、低溫、高溫、鹽堿、病蟲害、環(huán)境污染等逆境脅迫是植物科學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)共同關(guān)心的重大科學(xué)問題。逆境條件可以通過境信號在細(xì)胞中通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞，最終誘導(dǎo)基因表達(dá)；逆境脅迫也可以通過代謝來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，合成抗凍蛋白（Antifreeze proteins，AFPs）、熱激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）、滲透調(diào)節(jié)蛋白（Osmotin）等抗逆蛋白質(zhì)。然而植物抗逆的分子機(jī)制并不清楚?；诹魇郊?xì)胞儀在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白功能研究等方面的強(qiáng)大功能，已被廣泛應(yīng)用于植物抗逆研究和植物抗病研究中，流式細(xì)胞儀為抗逆因子和抗病因子的表達(dá)和活性檢測提供了很好的工具[8-12]。

2.7 植物育種研究 植物育種是植物科學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究領(lǐng)域的另一重大科學(xué)問題，包括作物育種、園林植物育種等。1984年，LAAT和BLAAS制備了模式植物纖細(xì)單冠菊[Haplopappus gracilis（Nutt.）Gray]的完整染色體懸浮液，通過流式細(xì)胞術(shù)分離了2種染色體類型，開創(chuàng)了流式細(xì)胞遺傳學(xué)[13]。

流式細(xì)胞儀根據(jù)DNA含量的多少可以判斷染色體的數(shù)量，從而可以鑒定植物倍性，達(dá)到快速準(zhǔn)確的效果，尤其適用作物育種群體檢測如多倍體育種。另一方面，通過對植物原生質(zhì)體及染色體的分選使從分子水平上篩選特定優(yōu)良基因，導(dǎo)入優(yōu)良基因，改造物種成為了可能。流式細(xì)胞儀在植物育種中的應(yīng)用，在提高作物抗逆能力和作物產(chǎn)量、培育園藝花卉等領(lǐng)域有著重要的研究意義。

3 流式細(xì)胞儀檢測方法應(yīng)該舉例--細(xì)胞增殖能力

用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖能力的方法主要有以下兩種[13-17]：

3.1 相對計(jì)數(shù)法 細(xì)胞增殖最直接的結(jié)果就是細(xì)胞數(shù)目的增加，如果控制樣品的體積一定，細(xì)胞數(shù)目的增加就是細(xì)胞濃度的增加，那么在同一臺儀器上用相同的分析速度上樣計(jì)數(shù)時(shí)，濃度大的樣品單位時(shí)間內(nèi)被檢測到的細(xì)胞數(shù)越多，上樣相同時(shí)間后得到的相對細(xì)胞數(shù)也就越多。同時(shí)也可以設(shè)置檢測相同數(shù)目的細(xì)胞個(gè)數(shù)后儀器自動停止并計(jì)時(shí)，通過分析各個(gè)檢測樣品的時(shí)間來比較細(xì)胞數(shù)目的相對多少，如果相同處理下樣品檢測時(shí)間短，則說明該樣品的細(xì)胞濃度高，即細(xì)胞數(shù)目多；反之，則說明樣品的細(xì)胞數(shù)量少。流式細(xì)胞術(shù)相對計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞增殖的原理：將對照組和各實(shí)驗(yàn)組控制在相同的條件下直接計(jì)數(shù)，然后比較計(jì)數(shù)結(jié)果得出增殖結(jié)論。

3.2 細(xì)胞周期法 在生物細(xì)胞中，DNA含量是比較恒定的參量，DNA含量隨著細(xì)胞增殖周期各時(shí)期不同而發(fā)生變化。（1）G0期細(xì)胞被認(rèn)為是不參與增殖周期循環(huán)的一群細(xì)胞，即為靜止細(xì)胞，其細(xì)胞DNA含量為較恒定的2C；G1期細(xì)胞具有增殖活性，參與細(xì)胞周期循環(huán)，G1期細(xì)胞與G0期細(xì)胞DNA含量相同，均為二倍體DNA含量；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后，DNA含量逐漸增加，從2C→4C值，一直到細(xì)胞DNA倍增結(jié)束，進(jìn)入G2期，最終進(jìn)入M期。在M期分裂為二個(gè)子細(xì)胞之前，G2和M期細(xì)胞的DNA含量均為恒定的4C值，即為四倍體細(xì)胞。（2）熒光染料和細(xì)胞DNA分子具有特異性結(jié)合，且有一定的量效關(guān)系，①DNA含量多少與熒光染料的結(jié)合成正比；②熒光強(qiáng)度與DNA分子結(jié)合熒光素多少成正比；③ 熒光脈沖與直方圖的通道值成正比。因此，F(xiàn)CM-DNA定量分析一個(gè)細(xì)胞增殖群時(shí)，可將二倍體DNA含量分布組方圖分為三部分，即G0/1、S、G2M。G0/1和G2M細(xì)胞峰的DNA分布均為正態(tài)分布，S期可以認(rèn)為是一個(gè)加寬的正態(tài)分布。

流式細(xì)胞術(shù)可以檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，所以可以檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞比例：靜止期/DNA合成前期（G0/1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期/有絲分裂期（G2M期）。

處于S期的細(xì)胞，DNA量處于二倍體和四倍體之間；處于G2/M期時(shí)，DNA量為四倍體。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%，S%及G2/M%，了解細(xì)胞的增殖能力，而細(xì)胞群體中處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例越高，說明細(xì)胞增殖越活躍。在植物抗逆生理學(xué)研究中，通常以S期細(xì)胞比率作為判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。正常細(xì)胞具有較恒定的DNA含量，而細(xì)胞病變過程中結(jié)構(gòu)或染色體的異常是很常見的。這種變化在流式分析中以DNA倍體指數(shù)的形式表現(xiàn)出來，這一指數(shù)對于病變細(xì)胞的早期診斷，所以可以通過檢測細(xì)胞DNA的含量分析S期所占比例值，進(jìn)而分析細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)領(lǐng)域的研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，幾乎涉及到各個(gè)方面，極大地推動著植物學(xué)科的發(fā)展，并在植物科學(xué)研究中扮演著重要的作用。

自從BD流式細(xì)胞儀發(fā)明以來，就不斷利用新的科學(xué)技術(shù)手段不斷革新，服務(wù)于生物學(xué)研究，本文通過對流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及研究方法介紹，期望能取得更好的進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)

[1]耿慧霞，王來，王強(qiáng).流式細(xì)胞儀在生物學(xué)中的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志，2005，22（4）：44-46.

[2]焦旭雯，趙樹進(jìn).流式細(xì)胞術(shù)在高等植物研究中的應(yīng)用[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2006，14（4）：354-358.

[3]Nunez R.Flow cytometry for research scientists：principles and applications[M].London：Horizon Scientific Press，2001：1-3.

[4]van den Engh G.New applications of flow cytometry.Curr Opin Biotechnol.1993，4（1）：63-68.

[5]Galbraith DW.Cytometry and plant sciences：a personal retrospective.Cytometry A.2004，58（1）：37-44.

[6]Fleury D，Himanen K，Cnops G，Nelissen H，et al.The Arabidopsis thaliana homolog of yeast BRE1 has a function in cell cycle regulation during early leaf and root growth.Plant Cell.2007，19（2）：417-432.

[7]焦旭雯，趙樹進(jìn).流式細(xì)胞術(shù)在高等植物研究中的應(yīng)用[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2006，14（4）：354-358.

[8]Nunez R.Flow cytometry for research scientists：principles and applications [M].London：Horizon Scientific Press，2001：1-3.

[9]耿慧霞，王來，王強(qiáng).流式細(xì)胞儀在生物學(xué)中的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志，2005，22（4）：44-46.

[11]van den Engh G.New applications of flow cytometry.Curr Opin Biotechnol.1993，4（1）：63-68.

[12]Galbraith DW.Cytometry and plant sciences：a personal retrospective[J].Cytometry A，2004，58（1）：37-44.

[13]DE LAAT AMM，BLAAS J.Flow—cytometfic characterization and sorting of plant chromosomes[J].Theor Appl Genet，1984，67：463-467.

[14] Marie D and Brown SC.A cytometric exercise in plant DNA histograms，with 2C values for 70 species[J].Biol Cell，1993，78（1-2）：41-51.

[15] Sergio J.Ochatt.Flow Cytometry in Plant Breeding[J].Cytometry PartA.73A，2008：581-598.

[16] Dolezel J and Bartos J （2005） Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.Ann Bot 95：99-110.

[17] Dolezel J，Kubaláková M，Bartos J，Macas J.Chromosome Res Flow cytogenetics and plant genome mapping.2004，12（1）：77-91.

（責(zé)編：張宏民）