正交試驗(yàn)優(yōu)選反枝莧總黃酮的提取工藝

摘要：為優(yōu)選反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）中總黃酮的最佳提取工藝，試驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算反枝莧中總黃酮的含量，通過正交試驗(yàn)考察不同因素和水平對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果表明，反枝莧中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度50%，料液比1∶15，水溶回流法提取3次，每次提取1.5 h。該工藝合理、簡單，適用于反枝莧總黃酮的提取，可為該資源的利用提供參考。

關(guān)鍵詞：反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）；總黃酮；正交試驗(yàn)；提取工藝

中圖分類號(hào)：TQ28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）19-4748-03

反枝莧是莧科一年生植物反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）的莖葉?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，反枝莧含有豐富的鐵、鈣、胡蘿卜素和維生素C，對(duì)青少年的生長發(fā)育和成人的身體健康都有幫助。反枝莧中沒有草酸，所含的鈣質(zhì)很容易被人體吸收，而豐富的鐵可以合成細(xì)胞中的血紅蛋白，有造血和攜帶氧氣的作用，被譽(yù)為“補(bǔ)血菜”。反枝莧中含有多種氨基酸，尤其是含有人體所必需的賴氨酸，而玉米、小麥、大米等谷物中含量則較少，因此常吃嫩反枝莧對(duì)人體健康是很有益的。

中醫(yī)認(rèn)為，反枝莧性涼，味甘，具有清熱明目、通利二便、收斂消腫、解毒止痢、抗炎止血等功效，可治療尿血、內(nèi)痔出血、扁桃腺炎、急性腸炎等癥。

黃酮類化合物是存在于自然界中的一大類化合物，在食品和醫(yī)藥工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用。本研究考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等因素對(duì)反枝莧中總黃酮提取率的影響，并以此4因素為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)選反枝莧中總黃酮最佳提取工藝條件，為反枝莧的進(jìn)一步深入開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 試驗(yàn)用反枝莧于2011年10月采自重慶醫(yī)科大學(xué)藥物園（經(jīng)鑒定為莧科反枝莧），粉碎，過篩，低溫密封干燥保存；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)153184-201006（購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；95%乙醇、無水甲醇、丙酮等均為分析純；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV765CRT型紫外可見分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；AL204型分析天平（萬分之一）[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HH-6型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；SB-3200DTD型超聲波清洗機(jī)（上海茸研儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg，以95%乙醇溶解，搖勻，定容至100 mL容量瓶中使之濃度為0.2 mg/mL。準(zhǔn)確移取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于25 mL容量瓶中，分別加水至6 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁1 mL，搖勻放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加95%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min。用紫外分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)其吸光度（A），以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.893x+0.002 5，r=0.999 5。

1.2.2 提取方法對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶15（m/V，g/mL，下同），提取時(shí)間1.5 h，考察不同的提取方法（水浴回流法、水煮法、超聲波法）對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.3 提取時(shí)間對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶15，水浴回流法提取3次，考察不同的提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4 提取溶劑對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，分別用50%、70%乙醇、無水甲醇及丙酮水浴回流法提取3次，料液比均為1∶15，提取時(shí)間1.5 h，考察不同提取溶劑對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.5 提取次數(shù)對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶15，水浴回流法提取1.5 h，考察不同的提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.6 料液比對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，回流法提取2次，提取時(shí)間1.5 h，考察不同的料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)反枝莧總黃酮提取率的影響因素[1-5]，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)L9（43）。4個(gè)因素分別為提取時(shí)間（A）、乙醇濃度（B）、提取次數(shù)（C）、料液比（D）。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方法對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 3種提取方法下反枝莧總黃酮的提取率見表2。由表2可見，以水浴回流法提取時(shí)反枝莧總黃酮的提取率最高，達(dá)0.834%，超聲波法提取效果次之，水煮法提取效果最差。因此選擇水浴回流法為反枝莧總黃酮的提取方法。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖1可見，反枝莧總黃酮的提取率隨提取時(shí)間的增加而增加，但提取時(shí)間增加到1.5 h后其提取率變化不大，故選擇提取時(shí)間為1.5 h。

2.1.3 提取溶劑對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖2可見，不同濃度的乙醇溶液作提取溶劑時(shí)，反枝莧總黃酮的提取率均較高，所以最后選擇乙醇溶液為反枝莧總黃酮的提取溶劑。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖3可見，反枝莧總黃酮提取率隨提取次數(shù)的增加而增加，但從節(jié)省溶劑和耗能角度考慮，選擇提取3次為宜。

2.1.5 料液比對(duì)反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖4可見，溶劑用量對(duì)反枝莧總黃酮提取率有一定影響，增加溶劑用量有利于總黃酮的滲出，但溶劑用量過大，不僅增加溶劑消耗，而且會(huì)增加濃縮回收溶劑的耗能。綜合分析，選擇料液比1∶15為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取反枝莧粉末2.0 g，按上述最佳提取條件提取，所得反枝莧總黃酮提取率為1.349%，RSD=1.63%，表明該工藝重現(xiàn)性良好。

3 小結(jié)與討論

1）本試驗(yàn)對(duì)蘆丁和反枝莧中提取的總黃酮的最大吸收波長進(jìn)行了比較考察，將反枝莧按照上述最佳條件提取總黃酮后顯色，在400～600 nm下掃描，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸收曲線對(duì)比，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰均在510 nm附近，說明本試驗(yàn)選擇510 nm為檢測(cè)波長測(cè)定其吸光度并計(jì)算總黃酮含量的方法可取。

2）正交試驗(yàn)表明，反枝莧中總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3次。

3）試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在測(cè)定反枝莧中總黃酮的時(shí)候，當(dāng)往樣品液中加入氫氧化鈉溶液時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些紅色結(jié)晶物，這種物質(zhì)的存在是否會(huì)影響測(cè)定結(jié)果還有待進(jìn)一步的研究。

4）反枝莧是一種分布廣泛的雜草，如何做到除草和利用的有機(jī)結(jié)合，本研究從反枝莧總黃酮含量測(cè)定及提取工藝研究方面做了有益的探索。

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