接種晚疫病病原菌對馬鈴薯水楊酸、乙烯合成關(guān)鍵酶基因表達的影響

摘要：以轉(zhuǎn)基因的抗晚疫病型馬鈴薯（Solanum tuberosum）株系DR1、DR3a和野生型株系DG為材料，通過半定量RT-PCR研究了接種晚疫病病原菌（Phytophthora infestans）生理小種89148-9后葉片中水楊酸和乙烯合成途徑關(guān)鍵酶苯丙氨酸解胺酶（PAL）基因（poPAL）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）合成酶（ACS）基因（poACS）的表達情況。結(jié)果表明，接種后3個株系都能誘導(dǎo)poPAL和poACS基因的表達，但大部分轉(zhuǎn)基因株系葉片內(nèi)該基因的誘導(dǎo)表達量高于野生型，并且其表達峰值多數(shù)早于野生型。說明poPAL和poACS基因可能參與了馬鈴薯的抗晚疫病反應(yīng)，但不同株系中這些基因的誘導(dǎo)表達模式不同，這可能是不同馬鈴薯株系抗、感晚疫病的原因所在。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯（Solanum tuberosum）；晚疫病病原菌（Phytophthora infestans）；水楊酸；乙烯；基因表達

中圖分類號：S532；Q786；S435.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4238-03

Effects of Infection of Phytophthora infestans on Gene Expressions of Key Enzymes in Salicylic Acid and Ethylene Biosynthesis in Potato

ZHU Jia-li1，DING Yan1，XU Hong-zhang1，XIN Cui-hua1，CAI Lu1，XIAO Huan-huan1，

HE Yan-hong2，LI Na1，GUO Jiang-bo1

（1. Inner Mongolia Key Laboratory of Biomass-Energy Conversion/School of Mathematics， Physics and Biological Engineering， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014010， Inner Mongolia， China； 2. Forestry College， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot 010020， China）

Abstract： Phenylalanine ammonia-lyase（PAL） and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid（ACC） synthase（ACS） are the key enzymes in the biosynthesis pathway of salicylic acid and ethylene respectively. Expression patterns of gene encoding these key enzymes（poPAL and poACS） in potato（Solanum tuberosum） were investigated by semi-quantitative RT-PCR after injection of Phytophthora infestans physiological strain 89148-9 to potato transgenic resistant strains DR1， DR3a and wild susceptive line DG. The results showed that expression of poPAL and poACS genes was increased in leaves of the three potato lines after inoculation of P. infestans. The expression level in transgenic lines was mostly higher than that in wild line and the peak value in transgenic lines generally appeared earlier to that in wild line. The results suggested that poPAL and poACS were related with the resistance to late blight in potato； but the expression models were different between transgenic lines and wild line， which might be responsible for resistance or susceptibility to P. infestans.

Key words： potato（Solanum tuberosum）； Phytophthora infestans； salicylic acid； ethylene； gene expression

收稿日期：2012-08-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31260344）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目（2011BS0506，2012MS0301）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目

（NJZZ11139）；內(nèi)蒙古科技大學(xué)李保衛(wèi)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目；內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳“青年科技英才支持計劃”項目

作者簡介：朱佳莉（1990-），女，江蘇丹陽人，在讀本科生，生物技術(shù)專業(yè)；通訊作者，郭江波（1976-），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，副教授，博士，

主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究，（電話）15044701654（電子信箱）primersyn@sina.com。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界第四大糧食作物，在緩解全球糧食安全問題中占有重要的地位[1]。馬鈴薯晚疫病則是限制馬鈴薯生產(chǎn)的第一大病害，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的損失，培育優(yōu)良的抗病品種、探明其抗病機制意義重大。

植物在受到病原菌的侵染后其體內(nèi)會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)以降低病害造成的傷害。其中體內(nèi)產(chǎn)生信號分子進而誘導(dǎo)一系列防衛(wèi)基因表達和代謝變化是植物抗病行而有效的方法之一。水楊酸（Salicylic acid，SA）和乙烯是植物體內(nèi)重要的信號分子，可以誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)[2，3]。本研究以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的2個馬鈴薯抗晚疫病株系DR1、DR3a和野生型株系DG為材料，利用水楊酸合成途徑中的關(guān)鍵酶——苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）基因（poPAL）和乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶——1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）合成酶（1-Aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）基因（poACS）的保守區(qū)設(shè)計特異引物，通過半定量RT-PCR研究接種晚疫病病原菌（Phytophthora infestans）生理小種89148-9后各株系中兩種酶基因的表達情況，為深入了解馬鈴薯抗晚疫病能力與水楊酸和乙烯信號分子介導(dǎo)植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)之間的關(guān)系提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以前期試驗獲得的轉(zhuǎn)基因抗晚疫病馬鈴薯株系DR1、DR3a和野生型株系DG為材料，采用苗缽（10 cm×10 cm）溫室培養(yǎng)。取生長8～10周的植株為接種對象。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯接種晚疫病病原菌 ①制備游動孢子。將生長14 d的晚疫病病原菌生理小種89148-9的孢子囊用無菌水沖洗到滅菌培養(yǎng)皿中，在4 ℃冰箱中放置6 h使其釋放游動孢子，然后鏡檢游動孢子濃度并稀釋調(diào)整到終濃度為5×104 個/mL用于接種。②接種。每株系只取中上部3片葉接種，每片葉接種20 μL游動孢子液，接種后置于接種箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為18～25 ℃、光照16 h/d，接種后24 h內(nèi)用塑料膜覆蓋保持100%的相對濕度，分別于接種后0、12、24、48、72 h取樣用于poPAL和poACS基因表達量的分析。

1.2.2 基因特異引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中發(fā)表的poPAL（序列號Z37106）和poACS（序列號AB041521）基因序列，使用軟件Prime 5.0設(shè)計特異引物，引物序列分別為poPAL，5′-GCTAGAGGTGCT

AGTGCTAAGGGATT-3′和5′-TTTGAAACCCTAGA

TAAGGAAATGGC-3′；poACS，5′-TCCTGGTGATGC

ATTTCTAGTTCCT-3′和5′-ATCCATCCAAATAAA TAGGCCAGCAT-3′。

1.2.3 目的基因半定量RT-PCR分析 植物總RNA采用天根生化科技（北京）有限公司植物總RNA提取試劑盒RNAprep法提取，cDNA的合成按照普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明進行。各株系cDNA濃度通過內(nèi)標引物（poactin，5′-GATGGTGTCAGCCACAC-3′和5′-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3′）來調(diào)整，然后以該cDNA為模板擴增。反應(yīng)程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，60 poPAL/57 poACS ℃ 45 s，72 ℃ 70poPAl（poactin）/40poACS s。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。RT-PCR半定量積分分析使用GelPro 60分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種晚疫病病原菌后各株系poPAL基因的表達情況

接種晚疫病病原菌生理小種89148-9對3個馬鈴薯株系poPAL基因的表達都有持久的誘導(dǎo)作用，從3個株系中都擴增出了長度約為1.2 kb的產(chǎn)物。對RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）和半定量積分分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因DR1株系中poPAL基因的表達量在接種后24 h時達到最大，然后隨著時間的延長其表達量迅速下降，到72 h時該基因的表達量顯著低于接種前水平；轉(zhuǎn)基因DR3a株系中poPAL基因的表達量也在接種后24 h時達到最大，并保持一段時間的高表達量然后緩慢下降；野生型DG株系中poPAL基因表達量在接種后12 h時達到最大，到48 h時仍保持在相對穩(wěn)定的水平上，接種72 h后該基因的表達量略低于接種前水平。除72 h時轉(zhuǎn)基因DR1株系中poPAL基因的表達量與野生型DG株系相當外，接種晚疫病病原菌后72 h內(nèi)轉(zhuǎn)基因DR1和DR3a株系中poPAL基因的表達量均明顯高于野生型DG株系。

2.2 接種晚疫病病原菌后各株系poACS基因的表達情況

接種晚疫病病原菌生理小種89148-9對3個馬鈴薯株系poACS基因的表達都有明顯的誘導(dǎo)作用，從3個株系中都擴增出了長度為681 bp的產(chǎn)物。對RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖3）和RT-PCR半定量積分分析（圖4）可以看出，DR1株系在接種后12 h時poACS基因的表達量達到最大，在12～48 h內(nèi)一直保持較高的表達水平，然后逐漸下降，但72 h時其表達量仍高于接種前；轉(zhuǎn)基因DR3a株系接種后12 h poACS基因表達量迅速升高，24 h時poACS基因的表達量略有升高，但與12 h時沒有顯著差異，之后poACS基因的表達量逐漸下降，到72 h時其表達量低于接種前水平；野生型DG株系接種后24 h時poACS基因的表達量達到最大，然后逐漸下降，到72 h時poACS基因的表達量已檢測不到。在整個觀察期內(nèi)，轉(zhuǎn)基因DR1和DR3a株系中poACS基因的表達量遠高于野生型DG株系，而且轉(zhuǎn)基因株系中的誘導(dǎo)為連續(xù)誘導(dǎo)，而野生型為不連續(xù)誘導(dǎo)，在接種后72 h時該基因不表達。

3 小結(jié)與討論

水楊酸在植物的系統(tǒng)獲得性抗性中是必不可少的信號物質(zhì)[4]，研究發(fā)現(xiàn)增加內(nèi)源水楊酸表達量或者外施水楊酸都可以誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種晚疫病病原菌生理小種89148-9后，在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系中都誘導(dǎo)了poPAL基因的表達，表明水楊酸可能是馬鈴薯抗晚疫病過程中重要的信號分子，這與前人的研究結(jié)果[8]一致。但同一株系不同時間和不同株系同一時間該基因的表達量存在一定的差異，說明轉(zhuǎn)基因株系可能通過調(diào)控poPAL基因誘導(dǎo)表達的強度來實現(xiàn)對晚疫病的抗性。

在高等植物中，ACC經(jīng)ACS或者ACC氧化酶（ACO）合成乙烯，它們是乙烯合成途徑的關(guān)鍵酶，而ACS和ACO受生物脅迫或者非生物脅迫正調(diào)控[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在接種晚疫病病原菌生理小種89148-9后，在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因和野生型株系中都誘導(dǎo)了poACS基因的表達，表明乙烯可能是馬鈴薯抗晚疫病過程中重要的信號分子，這與之前的報道一致[10]。但同一株系不同時間和不同株系同一時間該基因表達量有一定的差異，這說明轉(zhuǎn)基因株系可能通過對該基因誘導(dǎo)表達的強度和時序的調(diào)控來實現(xiàn)其對晚疫病的抗性。

本研究選用的2個轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系在接種晚疫病病原菌后都啟動了水楊酸和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，只是啟動的強弱和時序上有較大的差異。這表明并非只有抗病株系才啟動防御反應(yīng)機制，而是在植物與病原菌互作中，植物都具有潛在的防御反應(yīng)機制，這些防御反應(yīng)基因通過識別、信號傳遞和誘導(dǎo)，使植物自身防御系統(tǒng)被激活而相關(guān)防御反應(yīng)基因被誘導(dǎo)表達[11，12]。同時也支持了有關(guān)水楊酸和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在抗病防御反應(yīng)機制中的復(fù)雜性和可能存在多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑復(fù)雜的交叉與重疊作用的結(jié)論。但是各株系接種晚疫病病原菌后相關(guān)基因的啟動強度與時序性有較大的差異，這可能是由于不同植物與病原菌所組成的不同互作系統(tǒng)引起的，也可能就是抗、感晚疫病的原因所在。

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（責任編輯 向 闈）