貯藏溫度對紅肉臍橙(Citrus sinensis Osbeck)果實類胡蘿卜素含量的影響

王長鋒，陶能國*，黃師榮

(湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

果實色澤是柑橘的主要外觀品質(zhì)，隨著人們生活水平的提高，果實色澤已悄然成為消費者判斷果品接受與否或者物有所值的重要參考[1]。類胡蘿卜素是絕大多數(shù)柑橘品種的著色物質(zhì)，其合成受品種、成熟度、采收期、貯藏方式、貯藏條件和環(huán)境因素等的綜合影響[2-5]。醫(yī)學(xué)研究表明，柑橘果實類胡蘿卜素還具有清除人體有害自由基、增強人體免疫力、預(yù)防心血管疾病、防癌抗癌和預(yù)防維生素A缺乏癥等功能[6]。因此，柑橘果實類胡蘿卜素代謝已逐漸引起人們的濃厚興趣。

紅肉臍橙(Citrus sinensis Osbeck)是華盛頓臍橙的天然芽變，是迄今世界上唯一果肉因含番茄紅素和β-胡蘿卜素而著色粉紅的臍橙品種，20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)于委內(nèi)瑞拉，1990年由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所從美國引種至我國，在湖北、湖南、浙江、江西和福建等我國柑橘主產(chǎn)區(qū)均有一定面積的栽培[1,7-8]。此外，紅肉臍橙果實還含大量的線性類胡蘿卜素(如八氫番茄紅素等)，加之果實類胡蘿卜素代謝途徑未產(chǎn)生突變，因而成為研究柑橘果實類胡蘿卜素代謝的理想材料[9-11]。

本研究擬以紅肉臍橙為材料，探討常溫和低溫貯藏對柑橘果皮和果肉類胡蘿卜素含量的影響，以期為通過調(diào)節(jié)貯藏溫度改善柑橘果實色澤品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅肉臍橙(C. sinensis Osbeck)果實取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所，果實于2009年12月26日采收。低溫貯藏的樣品直接放置于4℃恒溫保鮮柜，常溫處理的樣品則置于20℃培養(yǎng)箱中保存，每80個果實為1小區(qū)，3次重復(fù)。從采收當(dāng)天開始，每隔1周收集果皮和果肉，冷凍干燥后用液氮研磨成粉末備用。

甲醇、乙腈、MTBE(色譜純) 美國Fisher公司；正己烷、丙酮、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鉀(分析純) 湖南師大化學(xué)試劑廠；番茄紅素、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；β-隱黃素、葉黃素、反式紫黃質(zhì)、八氫番茄紅素、花藥黃質(zhì)、α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 瑞士Carote Nature公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 706超低溫冰箱、FS60超聲波振蕩儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；J-20XP離心機 美國Beckman公司；5301真空濃縮儀 德國Eppendorf公司；Direct-Q3超純水制備設(shè)備 法國Millipore公司；U-2800紫外可見分光光度計 日本Hitachi公司；1525高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 類胡蘿卜素提取

類胡蘿卜素的提取參考Lee[7]方法稍有改進。分別稱取0.5g左右果皮和果肉干樣，加15mL提取劑(正己烷：丙酮：無水酒精＝2：1：1，V/V，含0.1‰ BHT)，超聲波萃取30min后4000×g離心10min，沉淀用15mL提取劑重復(fù)提取2次至無色。合并上清液，用飽和NaCl水溶液反復(fù)洗3次至中性，吸取上層液，用正己烷定容至20mL，將上層液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于2mL甲基叔丁基醚(MTBE)(含0.1‰ BHT)，再加2mL 10% KOH-甲醇溶液避光條件下皂化10h。加4mL飽和NaCl水溶液和2mL MTBE(含0.1‰ BHT)使之更好的分層，洗走水層，再加3次5mL飽和NaCl水溶液洗至中性。將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用1mL MTBE(含0.1‰ BHT)溶解定容備用。

1.4 類胡蘿卜素的HPLC分析

HPLC分析條件：2996PDA檢測器，YMCC30色譜柱；流動相：A：乙腈：甲醇=3：1 (含0.0l% BHT，0.05% TEA)，B：100% MTBE(含0.01% BHT)；流速為lmL/min；上樣體積為20μL，檢測波長設(shè)定為450nm。梯度洗脫：0min，A：B(95：5)；0～10min，A：B(95：5)；10～19min，A：B(86：14)；19～29min，A：B(75：25)；29～54min，A：B(50：50)；54～66min，A：B(26：74)；67min，A：B(95：5)。

Empower軟件控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理色譜結(jié)果。各組分含量以μg/g干質(zhì)量(μg/g DW)表示，總類胡蘿卜素含量以各鑒定組分的含量之和計算。番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素、反式紫黃質(zhì)、八氫番茄紅素、花藥黃質(zhì)和α-胡蘿卜素含量根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算；α-隱黃素和順式紫黃質(zhì)的含量參照β-隱黃素和反式紫黃質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組有3次重復(fù)，采用常規(guī)的分析方法來標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件，ANOVA來分析顯著性差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉臍橙果實類胡蘿卜素的組成

采用反相高效液相色譜(reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)技術(shù)，根據(jù)組分保留時間，比較標(biāo)準(zhǔn)品以及PDA檢測器檢測出的波譜特點，并參照前人文獻[7,12]，初步鑒定了紅肉臍橙果皮和果肉中類胡蘿卜素的各種組分(表1)。紅肉臍橙果皮共鑒定組分15個，分別為反式紫黃質(zhì)、順式紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、葉黃素、八氫番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、ζ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素等；紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素共鑒定出組分16個，分別為反式紫黃質(zhì)、順式紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、葉黃素、α-隱黃素、八氫番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、番茄紅素順式異構(gòu)體和番茄紅素等。

表 1 紅肉臍橙果實類胡蘿卜素組分的色譜和光譜特點Table 1 Chromatographic and spectral characteristics of the identifed carotenoids in ‘Cara Cara’ fruit

2.2 貯藏溫度對紅肉臍橙果皮類胡蘿卜素組分的影響

從圖1可以看出，貯藏的前5周內(nèi)，常溫有利于紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各類胡蘿卜素組分的積累，隨著貯藏時間延長，這種優(yōu)勢逐漸被低溫取代。常溫條件下，紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各組分含量呈現(xiàn)出現(xiàn)一個逐步上升的趨勢，這種趨勢隨著貯藏時間的延長而減弱直至含量降低，且不同組分出現(xiàn)含量高峰的時間差別較大。其中，總類胡蘿卜素、八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、花藥黃質(zhì)、反式紫黃質(zhì)、順式紫黃質(zhì)于采后3周達到高峰，含量分別為(464.70±45.37)、(212.88±25.28)、(3.73±0.57)、(2.39±0.35)、(10.48±1.91)、(59.99±3.99)和(159.42±9.66)μg/g(以干質(zhì)量計，下同)；而玉米黃素和β-隱黃素的含量高峰則出現(xiàn)在采后第1周，含量分別為(1.39±0.18)μg/g和(14.15±2.83)μg/g；葉黃素的含量甚微，勉強能檢測到。常溫貯藏6周后，紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各類胡蘿卜素含量基本保持穩(wěn)定。對低溫貯藏而言，紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各類胡蘿卜素組分含量隨貯藏時間延長逐漸增加?？傤惡}卜素、八氫番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-隱黃素、反式紫黃質(zhì)和順式紫黃質(zhì)含量于采后第9周達到峰值，分別為(327.18±58.59)、(123.63±19.43)、(1.78±0.20)、(42.45±6.45)、(28.47±6.48)μg/g和(120.64±23.69)μg/g；葉黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素和花藥黃質(zhì)的峰值出現(xiàn)在采后第6周，含量分別為(1.11±0.22)、(1.91±0.13)、(1.60±0.19)μg/g和(5.10±0.54)μg/g；隨著貯藏時間的延長，總類胡蘿卜素和各組分含量基本保持不變。

圖 1 貯藏溫度對紅肉臍橙果皮類胡蘿卜素含量影響Fig.1 Effect of storage temperature on carotenoid contents

2.3 貯藏溫度對紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素組分的影響

圖 2 貯藏溫度對紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素含量影響Fig.2 Effect of storage temperature on carotenoid contents

從圖2可以看出：低溫有利于紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素的積累。低溫貯藏條件下，紅肉臍橙果肉總類胡蘿卜素、八氫番茄紅素、番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素和葉黃素于采后第1周達到峰值，含量分別為(278.00±21.85)、(125.03±7.23)、(185.33±14.57)、(0.40±0.04)、(11.79±2.63)、(5.11±1.03)μg/g和(3.98±0.90)μg/g，且含量顯著高于常溫貯藏(P＜0.05)，隨著貯藏時間延長，上述組分含量基本保持穩(wěn)定。常溫條件下，紅肉臍橙果肉β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、α-隱黃素、β-隱黃素和葉黃素含量緩慢上升，貯藏10周時達到峰值(24.56±2.56)、(0.55±0.03)、(3.71±0.05)、(3.55±0.21) 和(5.55±0.07)μg/g，隨后下降至采收時水平；番茄紅素含量于采后第3周達到峰值(105.88±14.03)μg/g，隨后逐漸下降，至第11周時顯著低于采收時含量。常溫和低溫貯藏的紅肉臍橙果肉花藥黃質(zhì)含量變化趨勢類似，貯藏3周時達到峰值(4.49±0.63)μg/g和(5.35±0.31)μg/g，且兩者間含量無顯著差異(P＞0.05)，隨后逐漸降低。常溫貯藏的紅肉臍橙果肉順式紫黃質(zhì)和反式紫黃質(zhì)出現(xiàn)兩個小高峰，分別為貯藏第1周和第10周；而低溫貯藏的紅肉臍橙果肉順式紫黃質(zhì)和反式紫黃質(zhì)兩個高峰出現(xiàn)的時間則分別為第5周和第10周。

3 討 論

溫度是柑橘果實采后貯藏條件中對果實品質(zhì)影響最大的環(huán)境因子[13]。類胡蘿卜素對溫度極其敏感，偏離最佳著色溫度1℃都可以對果實著色產(chǎn)生顯著影響[14]。對柑橘果實色澤而言，15～25℃的溫度有利于果皮黃色類胡蘿卜素的積累，但柑橘果肉中類胡蘿卜素的含量基本保持穩(wěn)定[15-17]。

本研究也表明，采后紅肉臍橙果皮和果肉類胡蘿卜素的代謝存在明顯差別。常溫(20℃)不僅促進紅肉臍橙果皮玉米黃素和紫黃質(zhì)的積累，而且還能促進八氫番茄紅素等線性類胡蘿卜素的積累，從而使總類胡蘿卜素含量增加。這一結(jié)果與前人關(guān)于常溫(20℃)通常有利于溫州蜜柑黃色類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素、β-隱黃素、玉米黃素和紫黃質(zhì))的積累，促進柑橘果實著色的報道相似[16]。奇怪的是，紅肉臍橙果皮β-隱黃素在貯藏1周時少量增加，隨后保持較穩(wěn)定的水平，隨著貯藏時間延長至5周后又逐漸下降，顯著低于采收時的含量(P＜0.05)。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與品種特性有關(guān)。Van Wyk等[18]研究發(fā)現(xiàn)， 20℃能導(dǎo)致Palmer臍橙果皮著色品質(zhì)下降。常溫貯藏的紅肉臍橙果肉除β-胡蘿卜素、葉黃素，α-隱黃素含量于采后第10周急劇上升外，其余類胡蘿卜素含量只在貯藏前1周內(nèi)小幅增加，隨后保持較為穩(wěn)定的水平。

與前人報道類似[16]，在貯藏初期，低溫(4℃)能基本保持紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各組分的含量，但隨著貯藏時間的延長，各組分呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢，特別是八氫番茄紅素和β-隱黃素的含量在采后5周后急劇增加；而低溫(4℃)貯藏誘導(dǎo)紅肉臍橙果肉八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和紫黃質(zhì)等的積累。根據(jù)前人報道，番茄紅素的最佳合成溫度為15～25℃，5℃的低溫能顯著抑制番茄紅素的合成[19]。因此，低溫條件下紅肉臍橙果肉番茄紅素的積累說明形成番茄紅素的上游途徑開始大量啟動。在植物類胡蘿卜代謝途徑中，八氫番茄紅素的合成是關(guān)鍵步驟之一，受八氫番茄紅素合成酶(PSY)基因的遺傳控制，該基因的表達與柑橘果實類胡蘿卜素含量呈明顯的正相關(guān)[9-11,20]。從代謝途徑分析，紅肉臍橙八氫番茄紅素含量增加可能與低溫誘導(dǎo)PSY基因上調(diào)表達有關(guān)。這一假設(shè)與總類胡蘿卜素含量和番茄紅素下游代謝物(如β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和紫黃質(zhì)等)的增加相吻合。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，貯藏溫度對紅肉臍橙果皮和果肉類胡蘿卜素含量的影響存在組織特異性。常溫(20℃)對紅肉臍橙果皮著色的積極作用只維持在貯藏的前5周；低溫(4℃)能基本保持貯藏初期果皮類胡蘿卜素含量，但含量低于常溫貯藏。除貯藏10周時β-胡蘿卜素、葉黃素、α-隱黃素含量有一個小幅增加外，常溫對紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素總體影響不大；低溫貯藏的紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素含量于采后1周達到峰值，隨后含量基本保持穩(wěn)定。

[1] 徐娟.幾個柑桔產(chǎn)區(qū)果實色澤評價及紅肉臍橙(Citrus sinensis L. cv. Cara Cara)果肉呈色機理初探[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2002.

[2] FANCIULLINO A L, DHUIQUE-MAYER C, LURO F, et al. Carotenoid diversity in cultivated citrus is highly influenced by genetic factors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(12)： 4397-406.

[3] MOULY P P, GAYDOU E M, LAPIERRE L, et al. Differentiation of several geographical origins in single-strength Valencia orange juices using quantitative comparaison of carotenoid profiles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(10)： 4038-4045.

[4] MATSUMOTO H, IKOMA Y, KATO M, et al. Quantification of carotenoids in citrus fruit by LC-MS and comparison of patterns of seasonal changes for carotenoids among citrus varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(6)： 2356-2368.

[5] DHUIQUE-MAYER C, FANCIULLINO A L, DUBOIS C, et al. Effect of genotype and environment on citrus juice carotenoid content[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(19)： 9160-9168.

[6] FRASER P D, BRAMLEY P M. The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids[J]. Progress in Lipid Research, 2004, 43(3)： 228-265.

[7] LEE H S. Characterization of carotenoids in juice of red navel orange (Cara Cara)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(5)： 2563-2568.

[8] XU Changjie, FRASER P D, WANG Weijie, et al. Differences in the carotenoid content of ordinary citrus and lycopene-accumulating mutants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(15)： 5474-5481.

[9] TAO Nengguo, HU ZhiYong, LIU Qin, et al. Expression of phytoene synthase gene (Psy) is enhanced during fruit ripening of Cara Cara navel orange (Citrus sinensis Osbeck)[J]. Plant Cell Reports, 2007, 26(6)： 837-843.

[10] ALQUéZAR B, RODRIGO M J, ZACARíAS L. Regulation of carotenoid biosynthesis during fruit maturation in the red-fleshed orange mutant Cara Cara[J]. Photochemistry, 2008, 69(10)： 1997-2007.

[11] FANCIULLINO A L, CERCóS M, DHUIQUE-MAYER C, et al. Changes in carotenoid content and biosynthetic gene expression in juice sacs of four orange varieties (Citrus sinensis) differing in flesh fruit color[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(10)： 3628-3638.

[12] LIU Qin, XU Juan, LIU Yongzhong, et al. A novel bud mutation that confers abnormal patterns of lycopene accumulation in sweet orange fruit (Citrus sinensis L. Osbeck)[J]. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(15/16)： 4161-4171.

[13] TIETEL Z, LEWINSOHN E, FALLIK, E. Importance of storage temperatures in maintaining flavor and quality of mandarins[J]. Postharvest Biology and Technology, 2012, 64(1)： 175-182.

[14] YOUNG L B, ERICKSON L C. Influences of temperature on color change in Valencia oranges[J]. Proceedings of the American Society for Horticultural Science, 1961, 78： 197-200.

[15] WHEATON T A, STEWART I. Optimum temperature and ethylene concentration for postharvest development of carotenoid pigments in citrus[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1973, 98(2)： 337-340.

[16] MATSUMOTO H, IKOMA Y, KATO M, et al. Effect of postharvest temperature and ethylene on carotenoid accumulation in the flavedo and juice sacs of Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.) fruit[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(11)： 4724-4732.

[17] RODRIGO M J, ZACARIAS L. Effect of postharvest ethylene treatment on carotenoid accumulation and the expression of carotenoid biosynthetic genes in the flavedo of orange (Citrus sinensis L. Osbeck) fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2007, 43(1)： 14-22.

[18] VAN WYK A A, HUYSAMER M, BARRY G H. Extended lowtemperature shipping adversely affects rind colour of ‘Palmer Navel’ sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osb.] due to carotenoid degradation but can partially be mitigated by optimizing post-shipping holding temperature[J]. Postharvest Biology and Technology, 2009, 53(3)： 109-116.

[19] JAVANMARDI J, KUBOTA C. Variation of lycopene, antioxidant activity, total soluble solids and weight loss of tomato during postharvest storage[J]. Postharvest Biology and Technology, 2006, 41(2)： 151-155.

[20] KATO M, IKOMA Y, MATSUMOTO H, et al. Accumulation of carotenoids and expression of carotenoid biosynthetic genes during maturation in Citrus fruit[J]. Plant Physiology, 2004, 134(2)： 824-837.