兩種多孔生物玻璃支架材料的體外細(xì)胞相容性研究

章燕　蔣欣泉　張秀麗　王德平　甄蕾

[摘要] 目的 對比研究采用同樣原料但以不同方法制備的兩種多孔生物玻璃支架材料的體外細(xì)胞相容性。方法 溶膠-凝膠法制備A/W生物活性微晶玻璃（4006材料），熔融法制備多孔生物活性玻璃（45S5材料）。體外誘導(dǎo)分離培養(yǎng)及鑒定兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs），通過材料浸提液細(xì)胞毒性實驗（MTT法）、細(xì)胞黏附實驗、倒置相差顯微鏡、掃描

電鏡和環(huán)境掃描電鏡比較4006材料和45S5材料對BMSCs細(xì)胞黏附和生長的影響，并探索與材料復(fù)合的最佳BMSCs細(xì)胞懸液濃度。結(jié)果 4006材料浸提液培養(yǎng)1 d時，其細(xì)胞活力與純培養(yǎng)液間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；但培養(yǎng)3 d后，

其細(xì)胞活力低于純培養(yǎng)液（P<0.01）。45S5材料浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞活力明顯低于純培養(yǎng)液（P<0.01）。細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)后，鏡下見BMSCs在4006材料孔隙內(nèi)貼壁生長良好，分泌基質(zhì)活躍；而在45S5材料上細(xì)胞黏附生長較差。BMSCs與4006材料的黏附量隨接種細(xì)胞濃度升高而升高，細(xì)胞懸液濃度為2×107 個·mL-1時的細(xì)胞黏附量最高。結(jié)論 溶膠-凝膠法制備的A/W生物活性微晶玻璃具有良好的生物活性和細(xì)胞相容性，具有作為骨組織工程支架材料的潛能。與其復(fù)合的細(xì)胞懸液濃度需要2×107 個·mL-1或以上。

[關(guān)鍵詞] 骨組織工程； 支架； 生物活性微晶玻璃； 溶膠-凝膠法； 骨髓基質(zhì)細(xì)胞； 細(xì)胞相容性

[中圖分類號] R 318.08 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.019

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，利用種子細(xì)胞和支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨的方法，為骨缺損修復(fù)提供了一個嶄新的思路。種子細(xì)胞培養(yǎng)與支架材料研制是組織工程學(xué)的兩大核心環(huán)節(jié)。含有磷灰石（apa-

tite）和硅灰石（wollastonite）微晶相的生物陶瓷材料被命名為A/W生物活性微晶玻璃（apatite/wollastonite bioactive glass-ceramic，A/W BGC），這種材料在保持了良好生物活性的同時，其力學(xué)性能也接近于自然骨[1]。A/W BGC的制備及其作為骨組織工程中細(xì)

胞支架材料的研究，目前國內(nèi)外尚處于起步階段[2-3]。

A/W BGC中基礎(chǔ)玻璃的制備方法包括傳統(tǒng)的熔融法和新的溶膠-凝膠法兩種，其中溶膠-凝膠法得到的生物玻璃具有更大的比表面積，能夠為含碳羥磷灰石的形成提供更多的Si-OH成核位置點，提高微晶玻璃的生物活性，且溶膠-凝膠法制備的生物玻璃中的Ca2+比熔融法制備的更容易溶解[4]。溶膠-凝膠法制備的A/W BGC是否更適合組織工程的要求，目前尚無定論。

本研究通過體外實驗對比研究原料同組分的溶膠-凝膠法制備的A/W BGC玻璃和傳統(tǒng)熔融法制備的多孔生物活性玻璃的細(xì)胞相容性。從材料浸提液細(xì)胞毒性、材料與細(xì)胞的復(fù)合、倒置相差顯微鏡、掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）和環(huán)境掃描電鏡（environmental scanning electron micros-cope，ESEM）觀察等方面，評價兩種多孔生物玻璃

支架材料的細(xì)胞相容性，預(yù)測其作為骨組織工程支架材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、材料及設(shè)備

3月齡新西蘭實驗兔1只，體質(zhì)量2.1 kg，雌性，健康，無骨骼系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。ㄆ胀墝嶒?/p>

動物，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供）。

戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司

進口分裝），肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥有限公司），DMEM（Gibco-BRL公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、維生素C（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、地塞米松、β-磷酸甘油鈉、青霉素、鏈霉素、MTT粉（Sigma公司，

美國），堿性磷酸酶試劑盒（上海放射免疫分析技術(shù)研究有限公司）。

恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Hera公司，德國），

倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（SS-325型，Tomy公司，日本），酶聯(lián)免疫分析儀（BP800型，Bioht公司，芬

蘭），環(huán)境掃描電鏡（QUANTA-200型，Philips公司，荷蘭）。

1.2 多孔生物材料的制備與檢測

由同濟大學(xué)材料學(xué)院用同樣組分[MgCO3、CaCO3、NH3·H2O、SiO2、C2H5OH、Ca（H2PO4）2·H2O、CaF2、

Ca（NO3）2·4H2O、Mg（NO3）2·6H2O、HCl等]的原料，采用溶膠-凝膠法制備新型多孔A/W BGC（4006材

料），孔隙率為70%以上，開口氣孔率超過60%，孔徑200～500 μm；采用傳統(tǒng)熔融法制備多孔生物活性玻璃（45S5材料），孔隙率為70%，孔徑250～500 μm。

制備成底面6 mm×6 mm、厚度4 mm的立方狀，高溫高壓消毒后備用。

1.3 兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，

BMSCs）的體外誘導(dǎo)分離培養(yǎng)及鑒定

將配制好的3%戊巴比妥鈉液（30～40 mg·kg-1）從兔一側(cè)的耳緣靜脈無菌操作下注射進行麻醉。麻醉完全后在無菌條件下抽取新鮮骨髓2 mL，用選擇培養(yǎng)基進行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、分離、純化、擴增。以Von Kossa染色、細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測方法對分離純化的細(xì)胞進行成骨性能鑒定[5]，得到一定數(shù)量、有成

骨潛能的BMSCs作為種子細(xì)胞。收集細(xì)胞后，配制成以下密度的細(xì)胞懸液：0.2×104、0.4×104、0.6×104、0.8×104、1.0×104、1.2×104、1.4×104、1.6×104、1.8×104、2.0×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106個·mL-1，每種密度接種8孔進行培養(yǎng)，并用MTT法繪制細(xì)胞密度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將實驗中分離培養(yǎng)得到并已經(jīng)驗證

有成骨性的兔BMSCs傳代培養(yǎng)至第3～5代用于以下

實驗。

1.4 材料浸提液細(xì)胞毒性實驗

將同樣規(guī)格大小的兩種支架材料（4006、45S5）

計算表面積后，按3 cm2·mL-1的比例使用條件培養(yǎng)液浸泡，37 ℃下浸提2 d，得到浸提液。取材料浸提液與條件培養(yǎng)液按比例配成100%（即純材料浸提液）、50%、25%、12.5%、6.25%、0%（即純條件培養(yǎng)液）的溶液。

將BMSCs用胰酶消化后，制成5×105 個·mL-1濃度的細(xì)胞懸液，接種入96孔板的72孔中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁生長后進行下一步實驗。用含不同

濃度浸提液的培養(yǎng)液替代96孔板中原純條件培養(yǎng)液進行細(xì)胞培養(yǎng)，每種濃度各培養(yǎng)6孔細(xì)胞。培養(yǎng)的第1、3天，每種濃度取3孔，MTT法測定各孔的吸光度（D490），取均數(shù)。另測未放入細(xì)胞的純材料浸提液（即空白浸提液）、未放入細(xì)胞的純條件培養(yǎng)液（即空白培養(yǎng)液）的吸光度值作為校正用。將純材料浸提液、純條件培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞得到的吸光度值，減去相應(yīng)空白浸提液和空白培養(yǎng)液的吸光度，得到校正值，用校正值進行分析。

1.5 最佳復(fù)合濃度篩選試驗

在24孔板中分別放入已用條件培養(yǎng)液預(yù)濕過24 h的4006材料和45S5材料，每種材料各12孔。預(yù)先制備好BMSCs細(xì)胞懸液，使其終密度分別為2×104、2×105、2×106、2×107 個·mL-1。用可調(diào)手動移液器將細(xì)胞懸液以每次10 μL的量，逐次滴加到材料上，直至材料飽和而沒有含細(xì)胞的培養(yǎng)液流出為止，每種濃度每種材料接種3孔。置于37 ℃、5%CO2及100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞穩(wěn)定黏附6 h后再加入培養(yǎng)液，使材料完全被浸沒，用量大約為每孔1.0 mL，隔日換液。每日在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞與材料的黏附情況。

在復(fù)合第3天細(xì)胞已穩(wěn)定貼壁黏附后，將復(fù)合有細(xì)胞的材料取出，移入另一48孔板的24孔中，加入條件培養(yǎng)液每孔500 μL。MTT法測量兩種材料上已黏附細(xì)胞的活力（吸光度）。具體操作如下。1）向已放入復(fù)合有細(xì)胞材料的24孔中，加入MTT液每孔50 μL，37 ℃、5%CO2及100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，讓MTT液與材料上復(fù)合的細(xì)胞作用4 h。吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，

DMSO）每孔375 μL。在微型振蕩器上振蕩10 min。2）將48孔板放入酶標(biāo)儀，在490 nm的光波下測定細(xì)胞吸光度（D490）。每組3份樣本，計算均數(shù)。3）將48孔板中測得的吸光度減去相應(yīng)材料空白浸提液的吸光度，得到校正吸光度。對照1.3中所得到的細(xì)胞濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，估算材料上細(xì)胞黏附的量。

1.6 BMSCs與生物材料復(fù)合后觀察

根據(jù)最佳復(fù)合濃度篩選試驗的結(jié)果，選用2×

107 個·mL-1濃度的細(xì)胞懸液以同樣方法分別接種預(yù)濕好的4006材料、45S5材料。逐日使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長及與支架材料的附著情況。在材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的第4、7天，進行SEM和ESEM檢查，觀察細(xì)胞在材料表面的附著生長情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

MTT法繪制的細(xì)胞濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

細(xì)胞的吸光度隨著細(xì)胞濃度增加而增加。

圖 1 細(xì)胞濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig 1 Standard curve of cell density to the absorbance

2.2 材料浸提液細(xì)胞毒性實驗

純材料浸提液和純條件培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞1、3 d時的吸光度見表1、2。4006材料浸提液培養(yǎng)1 d時，其細(xì)胞活力與純培養(yǎng)液間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；

但培養(yǎng)3 d后，其細(xì)胞活力低于純培養(yǎng)液（P<0.01）。

45S5材料浸提液培養(yǎng)1、3 d時，其細(xì)胞活力均低于純培養(yǎng)液（P<0.01）。

MTT檢測結(jié)果表明：4006材料與45S5材料培養(yǎng)細(xì)胞的吸光度隨浸提液用量的減少而升高，0%浸提液組（即純培養(yǎng)液）培養(yǎng)細(xì)胞的吸光度均為各組中最高（圖2）。

2.3 最佳復(fù)合濃度篩選試驗

不同濃度細(xì)胞懸液接種后黏附細(xì)胞的MTT結(jié)果見表3。從表3可見，4006材料上黏附細(xì)胞活力的吸光度隨接種細(xì)胞懸液濃度的升高而升高，即BMSCs與4006材料的黏附量隨接種細(xì)胞濃度的升高而升高。45S5材料上黏附細(xì)胞的吸光度隨接種細(xì)胞濃度變化不大。兩種材料之間相比較，2×106 個·mL-1和

2×107 個·mL-1濃度時其細(xì)胞黏附率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，4006材料的細(xì)胞黏附率明顯高于45S5材料（P<0.01）。同種材料內(nèi)相比較時，2×106 個·mL-1、2×107 個·mL-1濃度時的細(xì)胞黏附率與其他濃度間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，2×107 個·mL-1濃度時的細(xì)胞黏附量最高（P<0.01）。4006材料在2×107 個·mL-1濃度

時，黏附細(xì)胞的吸光度為0.653 330±0.052 624，對照細(xì)胞濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，對應(yīng)的細(xì)胞濃度約為4×104 個·mL-1。這說明材料上有效細(xì)胞黏附量還是相對較低。

2.4 BMSCs與生物材料復(fù)合后觀察

2.4.1 倒置相差顯微鏡觀察 BMSCs與4006材料復(fù)合3 d后，材料周圍散落的未黏附細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部貼壁生長良好（圖3左）；BMSCs與45S5材料復(fù)合3 d

后，材料溶解不規(guī)則，周圍培養(yǎng)皿底未見貼壁生長活細(xì)胞，僅見大量散在黑色物質(zhì)，為規(guī)則晶體樣物質(zhì)（圖3右），推測為材料降解析出的晶體。

2.4.2 SEM觀察 BMSCs與4006材料復(fù)合4 d后，細(xì)胞黏附于4006材料表面增殖生長，材料的自然孔隙中可見細(xì)胞長入（圖4左），7 d時細(xì)胞數(shù)量明顯增多，生長情況良好，細(xì)胞分泌基質(zhì)活躍。BMSCs與45S5材料復(fù)合后，未見明顯的細(xì)胞形態(tài)，僅見少量的纖維樣物質(zhì)附著于材料表面，但可見活化磷灰石樣晶體（圖4右）。

3 討論

3.1 支架材料

應(yīng)用于骨組織工程的無機材料主要是生物陶瓷類，生物活性微晶玻璃也稱為生物活性玻璃陶瓷，其結(jié)構(gòu)、性能和制備方法與玻璃和陶瓷都有所不同，但在性能上集中了二者的共同優(yōu)點。Hench等[6]發(fā)明了部分降解含磷和鈣的硅玻璃，其中一類具有特殊結(jié)構(gòu)，稱為生物活性玻璃（bioactive glass，BG）。其表面部分在水溶液中可形成富含氧化硅和鈣、磷離子的膠樣層，有利于羥磷灰石的形成和沉積，然后羥磷灰石晶體可吸附膠原黏多糖和糖蛋白，從而在BG與骨和軟組織之間形成一層無機-有機界面，這種化學(xué)結(jié)合方式非常強烈而穩(wěn)定，有利于新生骨組織在BG表面直接形成。

A/W BGC的制備分為基礎(chǔ)玻璃的制備和熱處理加工兩步?；A(chǔ)玻璃的制備包括熔融法和溶膠-凝膠法兩種。溶膠-凝膠法與熔融法相比，具有較高的化學(xué)均勻性、較低的反應(yīng)溫度、可控的顆粒尺寸和形狀、方便制膜和涂層、更均一的相分布等特點。溶膠-凝膠法制備生物材料時，由于溶劑的揮發(fā)等原因，還會在生物材料顆粒中生成大量的5～100 nm的微孔，其表面積是熔融法制備的同種材料的上萬倍，更大的比表面能夠為含碳羥磷灰石的形成提供更多的Si-OH成核位置點，提高微晶玻璃的生物活性，同時使Ca2+的溶解更加容易，這與其具有更高的化學(xué)活性和更加開放的結(jié)構(gòu)有關(guān)[5]。

3.2 生物玻璃材料浸提液的細(xì)胞毒性

組織工程要求生物材料不僅要具有良好的機械強度和代謝性能，更要具有良好的生物相容性，利于細(xì)胞的黏附、生長和分化。本研究對溶膠-凝膠法制備的4006材料和傳統(tǒng)熔融法制備的45S5材料的細(xì)胞相容性進行分析，結(jié)果表明，不同濃度的4006材料浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的吸光度（D490）隨浸提液用量的減少而升高，45S5材料浸提液中卻沒有類似規(guī)律性變化。研究同時表明，不同濃度的4006材料和45S5材料浸提液所培養(yǎng)細(xì)胞的吸光度均小于純條件培養(yǎng)液（即0%浸提液組）所培養(yǎng)細(xì)胞的吸光度，說明材料浸提液與純培養(yǎng)液相比仍有一定差異。培養(yǎng)1 d時，4006材料浸提液與純培養(yǎng)液相比，其細(xì)胞毒性無統(tǒng)計學(xué)差異。培養(yǎng)3 d后，吸光度低于純培養(yǎng)液組（P<

0.01）。說明在培養(yǎng)3 d時，4006材料浸提液所培養(yǎng)細(xì)胞的活力低于純培養(yǎng)液組，這可能與4006材料浸提液內(nèi)細(xì)胞增殖速度比純培養(yǎng)液組中的細(xì)胞慢有關(guān)。4006材料浸提液可能對細(xì)胞的增殖有一定的影響。純45S5材料浸提液培養(yǎng)1 d和3 d時，細(xì)胞吸光度均低于純培養(yǎng)液組（P<0.01）。說明與培養(yǎng)液相比，45S5

材料的浸提液有一定的細(xì)胞毒性。溶膠-凝膠法制備的4006材料的浸提液細(xì)胞毒性低于以熔融法制備的45S5材料。

3.3 最適接種細(xì)胞濃度

細(xì)胞與材料的相互作用是組織工程研究的主要領(lǐng)域， 其中細(xì)胞與材料的黏附是基礎(chǔ)，細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)酿じ?，才能進行遷移、分化和增殖。由于每種生物材料與細(xì)胞的黏附力不同，最適接種的細(xì)胞濃度也不相同。本研究采用不同濃度的細(xì)胞懸液接種材料，觀察對比細(xì)胞復(fù)合效果，從而選擇最適接種的細(xì)胞濃度為下一步組織工程骨構(gòu)建實驗作準(zhǔn)備。

目前關(guān)于與各種材料復(fù)合的細(xì)胞濃度眾說紛紜，細(xì)胞懸液濃度1×104～5×107 個·mL-1不等。閻俏梅等[7]對BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)、擴增后與凍干脫礦骨基質(zhì)體外附著的規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)：其黏附率隨接種細(xì)胞數(shù)量的增多而提高，但當(dāng)黏附率提高到一定程度時，增加接種細(xì)胞量黏附不再增加反而有所下降。當(dāng)接種密度為1.0×106 個·cm-2時，細(xì)胞與凍干脫礦骨之間有最大附著量。根據(jù)既往文獻報道所曾提及的細(xì)胞濃度，本實驗選用了2×104、2×105、2×106、2×107 個·mL-1共4個數(shù)量級濃度的細(xì)胞懸液，按同樣體積接種4006材料和45S5材料，通過檢測材料上細(xì)胞黏附率，來篩選該支架材料的最適接種細(xì)胞濃度的數(shù)量級。研究結(jié)果顯示：4006材料的細(xì)胞黏附率高于45S5材料，且4006材料上黏附細(xì)胞活力的吸光度隨接種細(xì)胞懸液濃度的升高而升高，2×107 個·mL-1細(xì)胞懸液與4006材料的附著率最高。45S5材料上黏附細(xì)胞的吸光度隨接種細(xì)胞濃度變化不大。建議在進一步的組織工程骨構(gòu)建實驗中，使用2×107 個·mL-1或以上濃度的細(xì)胞懸液與材料進行復(fù)合。但對照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞濃度-吸光度曲線，發(fā)現(xiàn)材料上有效細(xì)胞黏附量還是相對較低，尚待進一步提高細(xì)胞黏附率。

3.4 BMSCs與生物玻璃材料復(fù)合的情況

為了解BMSCs與生物玻璃材料復(fù)合的情況，本研究采用倒置相差顯微鏡、SEM和ESEM進行觀察。倒置相差顯微鏡下可見4006材料皿底細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常，說明4006材料旁細(xì)胞可正常生長，其細(xì)胞毒性較小。結(jié)合SEM和ESEM觀察結(jié)果，BMSCs與4006材料可以良好的黏附，表現(xiàn)出分泌基質(zhì)的生物學(xué)行為。由此說明，4006材料具有良好的細(xì)胞相容性。45S5材料皿底未見到正常生活細(xì)胞，溶液中可見材料析出的規(guī)則晶體。結(jié)合電鏡和SEM結(jié)果，45S5材料在鏡下只表現(xiàn)出活化的磷灰石晶體貌，基本沒有細(xì)胞的黏附。說明45S5材料細(xì)胞毒性較大，無論材料上還是溶液中，細(xì)胞都不能存活。此結(jié)果也可解釋最佳復(fù)合濃度篩選試驗中，45S5材料組吸光度明顯低于4006材料組和培養(yǎng)液對照組，不隨著接種細(xì)胞濃度變化而變化。由此可以得出結(jié)論：4006材料具有良好的細(xì)胞相容性，其作為支架材料的性能優(yōu)于45S5材料，但其與市場上其他種類支架材料的性能比較還需要進一步的實驗研究。

本研究結(jié)果表明：溶膠-凝膠法制備的A/W BGC比同組分熔融法制備的多孔生物活性玻璃具有更好的細(xì)胞相容性，具有作為組織工程骨支架材料的潛能。本實驗中以A/W BGC作為支架材料，與細(xì)胞進行復(fù)合，效果最佳的是2×107 個·mL-1濃度的細(xì)胞懸液。在后續(xù)組織工程骨構(gòu)建實驗中，建議使用2×107 個·mL-1或以上濃度的細(xì)胞懸液。

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（本文編輯 李彩）