高粱花葉病毒外殼蛋白的原核表達及其抗血清制備

王洪星 龔殿 孫玉娟 張雨良 王健華 劉志昕

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101）

甘蔗是最重要的糖料作物和最具潛力的能源作物，甘蔗栽培中大多以種莖作為繁殖材料和種質(zhì)交流材料［1］，因此容易造成病毒病的逐代積累和遠距離傳播。世界上報道的甘蔗病毒病害有13種之多［2-4］，在甘蔗病毒病中流行范圍最廣，且對產(chǎn)量和品質(zhì)影響最大的是甘蔗花葉病［5，6］。甘蔗花葉病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）是引起甘蔗花葉病的一種重要病原，自然界中可由多種蚜蟲以非持久方式傳播，易機械接種，自然寄主僅限于禾本科植物，在自然條件下只危害高粱和甘蔗［7，8］。SrMV是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的成員［9］，編碼346-350 kD蛋白質(zhì)的單個開放閱讀框，產(chǎn)物為一聚合蛋白，自身編碼的蛋白酶將多聚蛋白加工成10個成熟蛋白［10］。目前還未見SrMV CP基因的原核表達、抗血清制備的相關(guān)報道。本研究以SrMV-HN分離物染病植株總RNA為材料，采用RT-PCR方法克隆CP基因編碼區(qū)，插入到pET32a原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主菌Rosetta（DE3），擬實現(xiàn)CP基因的原核表達，并制備高效特異性抗血清，旨在為建立SrMV檢測體系進行田間樣品檢測打下了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗花葉病病樣及原核表達載體pET-32a由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶、DNA分子量標記（DL2000）、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、PCR 回收試劑盒等均購自大連寶生物工程公司。E.coli DH5α、Rosetta（DE3）菌株由本實驗室保存。透析袋購自Sigma公司。IPTG購自Promega公司。低分子量蛋白Marker購自Promega公司；BCIP/NBT底物顯色試劑盒、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購自Solarbio公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、甘氨酸、考馬斯亮藍R-250均購自Amresco公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。His-Tag單克隆抗體購自Novagen公司；Goat Anti-Mouse IgG（H&L）-AP購自北京康為世紀生物科技有限公司；其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產(chǎn)生化級或分析級試劑。

1.2 方法

1.2.1 重組原核表達載體pET32a-SrMV CP的構(gòu)建根據(jù)SrMV相關(guān)基因序列（GenBank登錄號：AJ310-197.1），基因位置：8424-9389。綜合考慮酶切位點引物設(shè)計的各項原則，設(shè)計引物。SrMV-CP引物對所選取的酶切位點為EcoRⅠ和Hind III；所需寡核苷酸引物由上海生物工程公司合成。SrMV-CP引物序列［13］：

SrMV-CP-F：5'- GAAGAATTCGCAGGGGGCGGTACGGT-3'，其中下劃線部分為EcoR I酶切位點，

SrMV-CP-R：5'- GCCAAGCTTTCAGTGGTGCTGTTGC-3'，其中下劃線部分為 Hind III酶切位點。方框部分表示與模板相同或互補配對的序列。

以甘蔗花葉病病樣的總cDNA為模板，SrMVCP-F和SrMV- CP-R為引物，進行PCR反應(yīng)：94℃預變性3 min ；94℃變性30 s，55℃ 退火30 s ，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃終止補償延伸10 min。取適量PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余的回收并純化。PCR產(chǎn)物純化采用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司），具體操作過程參照試劑說明書進行?；厥誔CR產(chǎn)物用T-A克隆方法克隆到質(zhì)粒pMD 19-T simple vector（TaKaRa公司）中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切（EcoR I/Hind III）鑒定后，陽性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，獲得目的基因重組克隆質(zhì)粒pMD 19T-SrMVCP。

分別用EcoR I/Hind III 在37℃水浴中過夜雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD 19T-SrMVCP和表達載體pET32a（+），回收具有黏性末端的CP片段和pET32a（+），16℃水浴連接過夜，將回收的目的基因CP片段連接到pET32a（+）上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR鑒定和EcoR I/Hind III質(zhì)粒雙酶切鑒定后，選擇陽性單克隆測序，獲得重組表達質(zhì)粒pET32a-SrMVCP。

1.2.2 融合蛋白的誘導表達和可溶性分析 以1∶100的接種量，將轉(zhuǎn)化進重組子pET32a-SrMVCP的大腸桿菌Rosetta（DE3），接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/mL）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)。OD600值達到0.5-0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，轉(zhuǎn)到30℃繼續(xù)培養(yǎng)3-6 h。

取1 mL誘導表達的菌液加入2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用50 μL雙蒸水懸浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4℃條件下，12 000 r/min離心1 min，取上清10 μL上樣，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色，分析融合蛋白的表達情況。收集經(jīng)誘導培養(yǎng)4 h的菌液樣品，采用超聲波破碎菌體細胞，離心后分別取1 mL上清液和沉淀按上述方法進行SDS-PAGE電泳，對融合蛋白進行可溶性分析。

1.2.3 融合蛋白的純化 擴大培養(yǎng)重組表達菌1 L，按上述條件誘導表達4 h。于4℃ 6 000 r/min離心30 min，菌體沉淀溶于50 mL Binding buffer中，冰浴放置30 min。經(jīng)超聲波破碎儀破碎細胞，冰浴放置30 min，4℃ 12 000×g離心30 min，上清過0.45 μm濾膜并通過Ni2+-NTA親和層析柱進行純化：用6 mL滅菌水洗滌瓊脂糖樹脂2次后，以6 mL Binding Buffer 平衡親和柱。上柱后用6 mL Washing Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗脫雜蛋白，再以 6 mL Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脫融合蛋白。純化后蛋白用透析袋經(jīng)100 mL 1×PBS透析3次即為純化蛋白。

1.2.4 抗血清制備及血清學檢測 純化的融合蛋白溶液經(jīng)過透析袋透析獲得溶于1×PBS的蛋白溶液。BCA法測定其濃度，與佐劑（1∶1）混勻，采用皮下多點注射抗原的方法免疫2只大白兔［10］，每只總注射量為2.0 mg，分3次免疫，每次間隔7-10 d，第3次免疫10 d后，每只白兔耳緣靜脈取血0.5-1.0 mL，分離抗血清。以1×PBS的蛋白溶液作抗原，ID-ELISA檢測抗血清效價，血清效價未符合要求則繼續(xù)免疫。血清效價符合要求后，心臟采血，分離抗血清，抗血清效價和工作濃度分別以提純的CP蛋白和感病的甘蔗葉片汁液為抗原進行IDELISA測定。

1.2.5 抗血清特異性鑒定 誘導表達后的菌體，進行SDS-PAGE凝膠電泳。用蒸餾水漂洗電泳后的凝膠，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)液中平衡10 min。利用電轉(zhuǎn)膜方法，以100 V，60 mA轉(zhuǎn)移1 h后，取出NC膜在蒸餾水中漂洗。將NC膜置于TBST緩沖液［20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20］配制的5%脫脂牛奶封閉液中4℃封閉過夜。封閉完成后，用TBST緩沖液漂洗NC膜后，將其轉(zhuǎn)入按1∶1 000稀釋的一抗TBST溶液，在37℃下，孵育40 min。取出NC膜，用TBST漂洗后，轉(zhuǎn)入按1∶30 000稀釋的堿性磷酸標記的山羊抗兔（IgG）TBST溶液中，37℃孵育40 min。取出NC膜，經(jīng)TBST漂洗后，在NC膜蛋白面滴加含有330 μg/mL NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70%的二甲基甲酰胺中）和165 μg/mL BCIP（0.5 g BCIP溶于10 mL 100%的二甲基甲酰胺中）的顯色液，直到條帶清晰后，用蒸餾水漂洗兩次，終止顯色反應(yīng)。取出NC膜晾干后進行掃描分析

1.2.6 田間樣品檢測 從海南各市縣采集到25株疑似甘蔗花葉病樣品進行ID-ELISA檢測，健康組培苗作陰性對照，抗血清的工作濃度為1∶1 000；同時通過RT-PCR方法進行驗證。

2 結(jié)果

2.1 CP基因克隆和表達質(zhì)粒的構(gòu)建

用PCR方法從病樣總cDNA中擴增獲得的CP基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴增片段大小約為987 bp（圖1）。表達重組質(zhì)粒pET32a-CP經(jīng)EcoR I/Hind III雙酶切驗證，出現(xiàn)特異性DNA條帶，其大小約為987 bp（圖 2），從而進一步證明已成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET32a-CP。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

圖 2 重組質(zhì)粒pET32a-CP酶切鑒定

2.2 CP基因的誘導表達及可溶性分析

分別在37℃、25℃和IPTG終濃度0.1 mmol/mL條件下，誘導表達pET32a-CP重組表達菌Rosetta（DE3）。取1 mL菌液樣品進行SDS-PAGE電泳分析，重組質(zhì)粒表達量在Rosetta（DE3）菌（圖 3-A）中遠高于BL21（DE3）（圖 3-B），因此采用在Rosetta（DE3）菌中表達。在Rosetta（DE3）菌中約53 kD處有一明顯區(qū)別的條帶，其大小與預估的融合蛋白大小符合。剩余菌液經(jīng)細胞破碎儀破碎細胞后，分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳分析（圖 4）融合蛋白的表達產(chǎn)物主要以可溶性的形式存在。同時對誘導條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，IPTG終濃度0.1-1 mmol/L、誘導溫度25-37℃、誘導時間1-6 h范圍內(nèi)，均可穩(wěn)定表達；IPTG終濃度、誘導溫度、誘導時間、不是其表達的決定因素。根據(jù)優(yōu)化條件確立了CP基因表達的最佳條件：IPTG終濃度為0.1 mmol/L，誘導時間為4 h，誘導溫度為30℃。

圖3 pET32a-CP在不同宿主菌中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖4 pET32a-CP重組菌表達產(chǎn)物的可溶性分析

2.3 融合蛋白的純化

在30℃，IPTG終濃度0.1 mmol/mL條件下，對重組表達菌進行誘導培養(yǎng)4 h。獲得的融合蛋白含有相對較多的可溶性蛋白，但同時也有一部分是包涵體蛋白。為了盡量保證融合蛋白CP的生物活性和簡便操作過程，選擇了上清進行可溶性蛋白純化。Ni2+-NTA親和層析純化中，雜蛋白經(jīng)100 mmol/L咪唑濃度的washing buffer洗脫后，與親和層析柱Ni2+螯合的目的蛋白純度已達要求。最終，用500 mmol/L咪唑濃度的washing buffer將融合蛋白溶于其中（圖 5）。

圖5 pET32a-CP重組菌表達產(chǎn)物SDS-PAGE檢測及目的蛋白純化

2.4 抗血清的制備和效價測定

圖6 pET32a-CP重組菌表達產(chǎn)物的可溶性分析

在注射抗原蛋白到白兔前，用ID-ELISA對白兔進行免疫前血清本底水平檢測，結(jié)果顯示，試驗所選用的家兔血清本底比較低，符合試驗要求。將純化獲得的融合蛋白作為免疫原，第一次與完全佐劑等比例混勻，第2、3次與不完全佐劑等比例混勻，采用肌肉與皮下注射相結(jié)合免疫家兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液和感病的甘蔗葉片汁液為抗原進行ID-ELISA測定抗血清效價和工作濃度。結(jié)果（表1）表明，當以提純的CP蛋白作抗原時，抗血清稀釋104倍仍明顯呈陽性反應(yīng)；當以發(fā)病甘蔗葉片汁液為抗原時，抗血清在稀釋103倍仍呈陽性反應(yīng)，抗血清的工作濃度為1∶1 000。

表1 不同稀釋度的抗血清與病樣的ELISA結(jié)果的OD值

2.5 抗血清特異性鑒定

經(jīng)Western blotting分析，結(jié)果（圖 6）顯示，兔抗CP抗血清僅與誘導表達菌SDS-PAGE凝膠53 kD條帶處有反應(yīng)，與其他條帶均無反應(yīng)。從而證明，抗血清能與純化后融合蛋白起特異性反應(yīng)。

2.6 田間樣品檢測

用所制備的抗血清進行了甘蔗花葉病樣品檢測，結(jié)果（表2）顯示，該抗血清測得結(jié)果基本與PCR檢測結(jié)果相符合，說明該抗血清較好的用于甘蔗組培苗的檢測。

圖 6 表達產(chǎn)物CP蛋白Western Blot檢測

表2 甘蔗疑似樣品ID-ELISA檢測結(jié)果

3 討論

制備高質(zhì)量的抗血清對抗原的質(zhì)量要求非常高，提取甘蔗中的SrMV病毒存在一定的困難。甘蔗體內(nèi)含有較多的多糖和酚類物質(zhì)，會影響病毒提純的效率；病毒粒子提純過程復雜繁瑣，需要專門的大型儀器設(shè)備（如超、高速離心機，透射電鏡），費時、費資、費力。這些大大限制了這類病毒的抗血清的制備。利用提純的病毒制備的抗血清，由于提純條件和純化技術(shù)的客觀限制，其中難免會含有某些寄主蛋白抗體，這很容易在后續(xù)的血清學反應(yīng)中造成假陽性反應(yīng)。而用改造好的工程菌來表達病毒的目的蛋白，得到的抗原量不但較多，而且其中不含寄主植物蛋白的成分，由此制備的抗血清會有較好的專化性，不容易出現(xiàn)假陽性。余乃通等［14，15］用香蕉束頂病毒?？诜蛛x物核穿梭蛋白（NSP）、CP制得香蕉束頂病毒抗血清；李向東等［16］將SCMV-CP基因克隆到表達載體pET22b（+），Adv Virus Res，制備了?；詮?、效價高的抗血清。

4 結(jié)論

本研究獲得了高粱花葉病毒膜蛋白基因序列，用原核表達載體表達CP基因的全長蛋白，從而用pET32a（+）原核表達載體成功構(gòu)建了CP基因表達質(zhì)粒。在誘導表達中，表達量很高，且主要以可溶性蛋白存在。同時優(yōu)化反應(yīng)條件發(fā)現(xiàn)，IPTG終濃度、誘導溫度、誘導時間，不是其表達的決定因素。本試驗在低溫條件下誘導表達，將獲得的可溶性融合蛋白進行純化，獲得大量可溶性蛋白，制備了?；院軓姷目寡?。

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