日本蟾蜍聚集素cDNA的克隆與序列分析

袁進(jìn)強(qiáng) 徐躍 楊仙玉 諸葛慧 張姝芳

（浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，臨安 311300）

聚集素（clusterin，CLU）也稱載脂蛋白J，前列腺抑制性睪酮信號-2或硫酸化糖蛋白-2，因其具有聚集細(xì)胞的功能而被命名為聚集素［1］。它在人體所有組織中都有表達(dá)［2］，參與細(xì)胞聚集［1］、脂質(zhì)運(yùn)輸［3］、細(xì)胞凋亡［4］、蛋白清理［5］和補(bǔ)體調(diào)節(jié)［6］等多種生理過程。在人類多種惡性腫瘤中clu基因表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系［2］。因此，成為近年來腫瘤治療的新靶點(diǎn)之一［7-9］。

鑒于蟾酥、蟾衣、蟾皮等中藥材廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療［10-12］，本研究室開展以日本蟾蜍（Bufo japonicus formosus）皮膚cDNA質(zhì)粒文庫為模板，通過菌落PCR篩選具有完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）的全長cDNA的工作。本研究篩選到日本蟾蜍clu全長cDNA序列，并運(yùn)用多種軟件對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，旨在為進(jìn)一步研究日本蟾蜍CLU蛋白生物學(xué)功能及其藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本蟾蜍皮膚cDNA質(zhì)粒文庫通過材料轉(zhuǎn)讓協(xié)議。日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所（AIST，Tsukuba，Japan）授權(quán)浙江農(nóng)林大學(xué)使用（作者楊仙玉在日本AIST博士后工作期間制備）。該文庫使用的載體為pSD64TR，上下游克隆位點(diǎn)分別為EcoR I和Xho I，載體上、下游引物為SP6（5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3'）和S.D.A.（5'-TTATGTAGCTTAGAGACTC-3'），cDNA的長度介于500-2 000 bp之間。

大腸埃希菌（E.coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α、PCR反應(yīng)試劑盒、2×PCR Master Mix等購自天根生化科技有限公司，DNA Ladder、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。引物合成與DNA測序委托上海生工生物技術(shù)有限公司或上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 日本蟾蜍皮膚 cDNA質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化 將cDNA質(zhì)粒文庫0.2 μL電擊轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中（40 μL），然后迅速加入37℃預(yù)熱的160 μL LB培養(yǎng)液，37℃恒溫振蕩復(fù)蘇45 min，取2 μL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB平板（含Amp 100 μg/mL），并在37℃恒溫培養(yǎng)12-15 h。

1.2.2 全長cDNA篩選 從平板上隨機(jī)挑取單菌落接種于10 μL的LB液體培養(yǎng)基中，以此菌液為模板實(shí)施菌落PCR。使用的引物是載體上游引物SP6和自行設(shè)計(jì)的含ploy（T）的cDNA下游引物（5'-AGATCTCTCGAGTTTTTTTTTTTT-3'）。反應(yīng)體系如下：菌液0.5 μL，2×PCR Master Mix 5 μL，SP6和ploy（T）引物（2 pmol/μL）各1 μL，補(bǔ)加滅菌超純水至10 μL，在反應(yīng)體系中補(bǔ)加礦物油10 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 120 s，30循環(huán)； 72℃8 min，4℃保存。PCR結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將擴(kuò)增出介于500-2 000 bp之間的PCR產(chǎn)物的菌落確定為陽性。

1.2.3 質(zhì)?；厥?、DNA測序與序列分析 將通過菌落PCR確定為陽性克隆的菌液0.2 μL接種于3.5 mL LB培養(yǎng)液中（含Amp 100 μg/mL），37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12-15 h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒回收并對其進(jìn)行EcoR I和Xho I 雙酶切鑒定，進(jìn)一步確定陽性克隆及質(zhì)粒濃度。首先委托公司將陽性克隆質(zhì)粒使用載體上游引物（SP6）對cDNA進(jìn)行正向測序。測序結(jié)果利用DNAstar查找cDNA的開放閱讀框（open reading frame，ORF），推導(dǎo)氨基酸序列，對具有合理開放閱讀框的克隆繼續(xù)委托公司使用載體下游引物（S.D.A.）進(jìn)行反向測序。

1.2.4 序列分析 利用DNAstar尋找ORF，推導(dǎo)其編碼蛋白的氨基酸序列并分析其理化性質(zhì)，運(yùn)用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測其結(jié)構(gòu)功能域，運(yùn)用CBS的SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽，運(yùn)用CBS的NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測Asn-X-Ser/Thr糖基化位點(diǎn)，運(yùn)用METAL DETECTOR V2.0（http：//cassandra.dsi.unifi.it/）預(yù)測二硫鍵位點(diǎn)，運(yùn)用NPS的GOR4（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，運(yùn)用ExPASy的COIL（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）預(yù)測卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，運(yùn)用ClustalX 2.0和MEGA 4.1軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 cDNA的篩選

將日本蟾蜍皮膚cDNA質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α獲得的菌落，以SP6和ploy（T）為引物，實(shí)施菌落PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，有一菌落PCR產(chǎn)物大小在1 600 bp左右（圖1-A）。將此菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)?；厥占捌銭coR I和 Xho I雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示該質(zhì)粒含有1 600 bp左右的cDNA（圖1-B）。將此質(zhì)粒委托DNA測序公司進(jìn)行了正、反雙向測序。

2.2 序列分析

2.2.1測序結(jié)果分析及其編碼蛋白的理化性質(zhì) 對測序結(jié)果校對并分析確定已克隆的cDNA其全長1 616 bp，具有1 332 bp的完整ORF、5'端30 bp和3'端254 bp的非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），編碼由443個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列在GenBank blast同源性分析表明，與其他物種的聚集素具有同源性，故將該cDNA克隆定為日本蟾蜍clu全長cDNA（圖2）（GenBank登錄號為JX035891）。日本蟾蜍clu的ORF推導(dǎo)的氨基酸序列中，正電荷氨基酸殘基（K，R）為55個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基（D，E）為69個(gè)，疏水性氨基酸（A，I，L，F(xiàn)，W，V）為141個(gè)，極性氨基酸殘基（N、C、Q、S、Y）為123個(gè)，分子量約為50.627 kD，pI理論值為5.13。

2.2.2 結(jié)構(gòu)預(yù)測 SMART預(yù)測日本蟾蜍CLU蛋白由兩條多肽鏈組成，這兩條多肽鏈分別與構(gòu)成聚集素的Cla、Clb家族同源；SignalP4.0預(yù)測該前體蛋白含有20個(gè)氨基酸殘基的信號肽（圖2），信號肽裂解位點(diǎn)在20和21氨基酸殘基之間，故推測克隆的日本蟾蜍clu cDNA編碼分泌蛋白。NetNGlyc預(yù)測蛋白中Asn-X-Ser/Thr糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在6個(gè)天冬酰胺糖基化位點(diǎn)，Asp-99、Asp-141、Asp-273、Asp-350、Asp-370和Asp-415（表1）。METAL DETECTOR預(yù)測蛋白二硫鍵位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)存在可形成二硫鍵的10個(gè)半胱氨酸殘基，Cys-98、Cys-109、Cys-112、Cys-117、Cys-125、Cys-281、Cys-291、Cys-298、Cys-301和Cys-309（圖2）。GOR4和COIL預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)表明，日本蟾蜍CLU在其兩端各形成一個(gè)卷曲螺旋（48-97 aa和336-391 aa）（圖3）。

表1 日本蟾蜍CLU中N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測

圖3 NCOILS 分析日本蟾蜍CLU蛋白的卷曲螺旋

2.2.3 氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 日本蟾蜍CLU蛋白氨基酸序列在NCBI中同源性分析發(fā)現(xiàn)，與非洲爪蟾（Xenopus laevis，NP_001080-775.1）的同源性最高，達(dá)到65%，與珠雞（Numida meleagris，AAW21812.1）、斑馬魚（Danio rerio，AAQ56181.1）、安樂蜥（Anolis carolinensis，XP_003229-606.1）、鴨嘴獸（Ornithorhynchus anatin-us，XP_00-1515556.2）、鵪鶉（Coturnix coturnix，CA-A33823.1）、小鼠（Mus musculus，NP_038520.2）、人（Homo sapiens，NP_001822）7種動物的同源性在41%-48%之間。在ClustalX軟件中對蟾蜍與8個(gè)物種的CLU蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對（圖4），發(fā)現(xiàn)各物種均含有信號肽序列，但其氨基酸組成和數(shù)量有所不同；可形成二硫鍵10個(gè)半胱氨酸殘基在不同物種之間完全保守；與人CLU序列比對，發(fā)現(xiàn)在C端卷曲螺旋中的357位為Val，其他物種為Leu，358 位的Leu物種之間完全保守，除斑馬魚的361位上為Phe外，其他物種都為Leu；預(yù)測N-糖基化位點(diǎn)中Asp-99、Asp-141、Asp-350和Asp-370與其他物種完全保守，而Asp-273和Asp-415不存在保守性，表明CLU存在種屬差異。

通過MEGA 4.1軟件鄰接法構(gòu)建氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），發(fā)現(xiàn)日本蟾蜍與同屬兩棲類的非洲爪蟾處于一個(gè)分支內(nèi)，與魚類匯于一個(gè)分支。兩種鳥類動物與爬行動物匯于一支。哺乳類最低等的鴨嘴獸與其他哺乳動物匯于一支，但與胎生哺乳動物人和鼠存在一定的差異。整個(gè)進(jìn)化樹表明CLU的進(jìn)化史遵循傳統(tǒng)動物進(jìn)化規(guī)律。

3 討論

本試驗(yàn)成功克隆到日本蟾蜍聚集素的全長cDNA，并對該cDNA和其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。SignalP分析該前體蛋白存在信號肽，暗示日本蟾蜍clu cDNA編碼蛋白為分泌蛋白。結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示日本蟾蜍CLU成熟蛋白是由兩條多肽鏈組成［9，13，14］，含有兩個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（48-97 aa和336-391 aa），與人CLU相似。在其C端卷曲螺旋中Val-3578、Leu-358和Leu-361有3個(gè)疏水性氨基酸殘基，其中后兩個(gè)氨基酸不同物種間比較保守，Val-357在人類則是Leu-357。此外，日本蟾蜍CLU成熟蛋白中有10個(gè)半胱氨酸殘基可形成5對二硫鍵，存在6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，這些特征在包括人的其他8種動物的CLU中完全保守［16-18］。

已有研究表明，人類分泌型CLU具有抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、保護(hù)細(xì)胞的功能［19，20］，但其作用機(jī)制還不十分清楚。目前，在RNA水平上抑制分泌型CLU表達(dá)，或使用寡核苷酸藥物OGX-011干擾分泌型CLU表達(dá)均能增強(qiáng)化學(xué)藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷力和降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，顯示出良好的臨床效果［7］。因此，抑制分泌型CLU對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)可能成為治療腫瘤的新途徑，CLU可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

4 結(jié)論

首次克隆到日本蟾蜍clu基因的全長cDNA，該基因編碼的蛋白具有與人類同源蛋白相似的結(jié)構(gòu)特征。日本蟾蜍CLU與其他8個(gè)物種CLU的氨基酸序列具有相似性。

［1］ Fritz IB, Burdzy K, Setchell B, et al. Ramrete testis fluid contains a protein（clusterin）which influences cell-cell interactions in vitro［J］. Biolreprod, 1983, 28（5）：1173-1188.

［2］ Shannan B, Seifert M, Leskov K, et al. Challenge and promise：roles for clusterin in pathogenesis, progression and therapy of cancer［J］. Cell Death and Differentiation, 2006, 13（1）：12-19.

［3］ Konstantinos NA, Maria TV, John PC, et al. Circulating clusterin（apolipoprotein j）levels do not have any day/night variability and are positively associated with total and LDL cholesterol levels in young healthy individuals［J］. Clin Endocrinol Metab, 2011, 96（11）：E1871-5.

［4］ Konstantin SL, Dmitry YK, Jing L, et al. Synthesis and functional analyses of nuclear clusterin, a cell death protein［J］. Biol Chem, 2003, 13（278）：11590-11600.

［5］ Wyatt AR, Yerbury JJ, Berghofer P, et al. Clusterin facilitates in vivo clearance of extracellular misfolded proteins cell［J］. Cell Mol Life Sci, 2011, 68（23）：3919-3931.

［6］ Kurosu T, Chaichana P, Yamate M, et al. Secreted complement regulatory protein clusterin interacts with dengue virus nonstructural protein［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 362（4）：1501-1056.

［7］ Chi KN, Hotte SJ, Yu EY, et al. Randomized phase ii study of docetaxel and prednisone with or without ogx-011 in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer［J］. Clin Oncol, 2010, 28（27）：4247-4254.

［8］ Zoubeidi A, Chi K, Gleave M. Targeting the cytoprotective chaperone, clusterin, for treatment of advanced cancer［J］. Clin Cancer Res, 2010, 16（4）：1088-1093.

［9］ Mahon MG, Lindstedt KA, Hermann M, et al. Multiple involvement of clusterin in chicken ovarian follicle development［J］. Biol Chem, 1999, 274（7）：4036-4044.

［10］ 張飛春, 孫文革, 高曉玲, 等. 蟾酥乙醇提取物抗腫瘤劑量效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究［J］. 藥物研究, 2011, 20（16）：23-24.

［11］ 繆珠雷, 張康, 楊鳴澤, 等. 蟾蛻抗腫瘤及增強(qiáng)免疫效應(yīng)研究［J］. 中國中藥雜志, 2010, 25（2）：211-214.

［12］ 曾洋, 張愛, 文筱. 干蟾皮的研究進(jìn)展［J］. 中國醫(yī)藥科學(xué), 2011, 1（15）：19-31.

［13］ Lars E, Chonn A, Ducrest D, et al. Murine clusterin：molecular cloning and mRNA localization of a gene associated with epithelial differentiation processes during embryogenesis［J］. Cell Biol, 1999, 122（5）：1119-1130.

［14］ Yang CR, Yeh S, Leskov K, et al. Isolation of Ku70-binding protein（KUBs）［J］. Nucleic Acids Res, 1999, 27（10）：2165-2174.

［15］ Choi-Miura NH, Takahashi Y, Nakano Y, et al. Identification of the disulfide bonds in human plasma protein SP-40, 40（apolipoprotein-J）［J］. Biochem, 1992, 112（4）：557-561.

［16］ Stewart EM, Aquilina JA, Easterbrook-Smith SB, et al. Effects of glycosylation on the structure and function of the extracellular chaperone clusterin［J］. Biochemistry, 2007, 46（5）：1412-1422.

［17］ 趙曉航, 何洪智, 王堃, 等. 食管鱗癌中clusterin 的糖基化修飾和表達(dá)定位改變［J］. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26（12）：1333-1336.

［18］ Comunale MA, Wang MJ, Rodemich-Betesh L, et al. Novel changes in glycosylation of serum Apo-J in patients with hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 2011, 20（6）：1222-1229.

［19］ Ammar H, Closset JL. Clusterin activates survival through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway［J］. Biochem, 2008, 283（19）：12851-12861.

［20］ Trougakos IP, Lourda M, Antonelou MH, et al. Intracellular clusterin inhibits mitochondrial apoptosis by suppressing p53-activating stress signals and stabilizing the cytosolic Ku70-Bax protein complex［J］. Clin Cancer Res, 2009, 15（1）：48-59.