細角螺微衛(wèi)星DNA富集文庫構(gòu)建及特征分析

李清薈, 陳曉姣, 黎中寶, 曹媛鈺, 陳麗娜, 戴 剛

(1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021; 2. 福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 福建 廈門 361021)

細角螺(Hemifusus ternatanus)俗稱響螺, 單殼類海產(chǎn)底棲動物, 屬腹足綱(Gastropoda), 新腹足目(Neogastropoda), 盔螺科(Galeodidae), 角螺屬(Hemifusus)。主要分布于中國東南沿海, 新加坡和日本海域。其肉肥, 美味, 具有滋補功能, 經(jīng)濟價值很高, 是高檔海珍品。近年來, 海域生態(tài)環(huán)境的惡化以及人類過度捕撈, 細角螺資源日趨衰減。為了防止細角螺進一步衰減, 人們將焦點轉(zhuǎn)向細角螺的人工育苗及繁殖生物學(xué)的研究上, 并且取得初步成功[1], 但仍處在實驗探索階段[2-3]。由于目前對細角螺種質(zhì)資源現(xiàn)狀了解甚少, 因此對細角螺進行種質(zhì)資源結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性等方面的研究, 這將對保護該物種的野生群體, 開展苗種繁育、良種培育等工作具有重要的意義。

微衛(wèi)星(microsatellites)DNA, 又稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(short tanderm reapeats, STR), 由中間的核心序列與其兩端的保守側(cè)翼序列組成, 核心序列為1～6個核苷酸為重復(fù)單元的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。由于微衛(wèi)星分子標記具有多態(tài)性豐富, 穩(wěn)定性好, 符合孟德爾遺傳和具有共顯性[4]等特點, 自1984年被Tautz等[5]首次提出可用于群體遺傳學(xué)研究后, 該技術(shù)就被廣泛應(yīng)用于動植物的遺傳多樣性, 遺傳變異, 遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構(gòu)建等方面。如斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[6], 大珠母貝(Pinctada maxima)[7]及 許 氏 平 鲉 (Sebastes schlegeli)[8]等 都 得 到很好的應(yīng)用。細角螺作為重要的經(jīng)濟貝類之一, 目前有關(guān)細角螺微衛(wèi)星分子標記的研究尚未見報道。本研究采用磁珠富集法構(gòu)建細角螺微衛(wèi)星富集文庫, 并分析微衛(wèi)星序列的特征, 為進一步篩選大量的微衛(wèi)星引物奠定基礎(chǔ), 進而為研究細角螺遺傳多樣性, 遺傳圖譜構(gòu)建, 人工育苗等提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細角螺樣品采自福建省泉州市惠安縣。

1.2 基因組DNA提取與酶切

根據(jù)上海生工生物工程技術(shù)有限公司的基因組小量抽提試劑盒(SK1252)提供的步驟, 稍做修改提取細角螺基因組DNA。所提DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-20℃保存?zhèn)溆?。用MseI酶切基因組DNA, 選取長度為300～1200bp的酶切片段進行連接。

1.3 接頭制備與連接

等體積混合與MseI酶切部位相匹配的Linker A(5'-GACGATGAGTCCTGAG-3')及LinkerB (5'-TAC TCAGGACTCAT-3'), 95℃變性10 min, 37℃10min, 最后冰置10min, 形成終濃度為10 μmol/L的雙鏈接頭待用。

連接體系30 μL: 酶切產(chǎn)物20μL, 接頭5μL(10 μmol/L), T4連接酶(5 U/μL)1μL, 10×T4 buffer 4 μL于37℃連接3.5h或22℃連接過夜。

1.4 探針雜交

雜交反應(yīng)前, 先將2×Hyb buffer(雜交緩沖液)預(yù)熱至 55℃?zhèn)溆? 將接頭連接產(chǎn)物95℃變性10 min。取變性后的連接產(chǎn)物與 bio-(CT)15、bio-(GT)15混合探針進行雜交反應(yīng), 雜交反應(yīng)體系為50 μL,其中包括25 μL 2×Hyb buffer, 10 μL接頭連接產(chǎn)物, 5 μL Bio-(CT)15(10μmol/L), 5 μL Bio-(GT)15(10 μmol/L) 以及5 μLddH2O。61℃反應(yīng)1h后, 放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 磁珠的平衡

取150 μL磁珠原液于1.5 mL離心管中, 混勻后置于磁力架上捕獲磁珠, 小心吸走上清液。用150μL(等比例)0.5×SSC洗滌磁珠兩次, 然后將磁珠重懸于150 μL的6×SSC, 0.1% SDS中。

1.6 磁珠富集及精制

將50 μL雜交產(chǎn)物與重懸磁珠混勻, 室溫下溫育30 min, 期間以每 1～2 min翻轉(zhuǎn)1次, 以使生物素和鏈霉親和素結(jié)合, 30 min后將離心管置于磁力架上, 吸去上清液。然后將離心管放置于磁力架上洗滌。室溫下, 用400 μL洗液I(2×SSC, 0.1% SDS)洗脫2次, 400 μL洗液Ⅱ(1×SSC, 0.1% SDS)在室溫下洗脫2次, 再用洗液Ⅱ于50℃洗脫兩次, 將不含微衛(wèi)星的序列除去, 然后用200 μL的0.1×TE于95℃溫育10 min后迅速吸取上清液至新管。加入400 μL經(jīng)-20℃預(yù)處理的無水乙醇, 并加入 20 μL NaAc/EDTA(pH8.0)螯合劑, 冰上靜置15 min后冷凍離心, 棄乙醇, 加入500 μL經(jīng)-20℃預(yù)處理的75%乙醇, 冰上放置15 min后冷凍離心10 min, 棄乙醇, 風干樣品。最后加入25 μL TE溶液, 放置4℃過夜, 使微衛(wèi)星DNA充分溶解于TE溶液中。

1.7 PCR擴增及純化

以寡聚核苷酸鏈MseIadapterA為引物對上述精制到的微衛(wèi)星DNA片段進行PCR擴增, 25 μL反應(yīng)體 系 包 括 10×Buffer(含 Mg2+) 4 μL, dNTP (10mmol/L)0.4 μL, Taq聚 合 酶(5U/μL), 0.2 μL,MseI-A引物1.4 μL (10 μmol/L), 17 μL ddH2O, 精制產(chǎn)物2 μL。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2 min, 20×(95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 60 s), 最后72℃保持10 min完成擴增片段的末端加尾A。用0.1%瓊脂糖檢測PCR擴增產(chǎn)物的片段大小。產(chǎn)物用GenClean PCR回收試劑盒(上海捷瑞)純化以除去多余的dNTPs及接頭等雜質(zhì)。

1.8 微衛(wèi)星DNA片段克隆、篩選和序列分析

將純化的PCR產(chǎn)物用pMD19-T載體于16℃連接4h。用感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行轉(zhuǎn)化克隆, 得到細角螺微衛(wèi)星文庫。挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中, 37℃振蕩培養(yǎng)過夜。用M13F/R通用引物對單克隆菌進行PCR檢測, 挑取片段大于等于500 bp的陽性克隆的菌液送至華大基因測序。

2 結(jié)果

2.1 克隆及測序結(jié)果

經(jīng)PCR篩選, 在354個陽性克隆中有248個含有大小合適的插入片段, 片段大小為500～1000bp, 從中隨機挑選220個克隆送出測序。圖1為部分篩選結(jié)果的電泳圖。

圖1 單克隆檢測結(jié)果 Fig. 1 Result of the monoclonal detection

依據(jù)Linda等[9]對微衛(wèi)星的劃定標準: 單核苷酸重復(fù)大于15次, 二核苷酸重復(fù)大于7次, 三核苷酸大于5次, 四核苷酸及五核苷酸大于4次。序列比對后用SSR hunter軟件進行微衛(wèi)星序列的查找, 結(jié)果表明在成隆功測序的220個陽性克隆中, 除5個不含有微衛(wèi)星序列外, 在剩余的215個克中共得到278個重復(fù)次數(shù)在5以上的微衛(wèi)星序列。依據(jù)Weber制定的標準[10], 在本研究篩選到的278個細角螺微衛(wèi)星序列中, 完美型171個, 占61.5 %, 非完美型80個, 占29.1%, 復(fù)合型26個, 占9.4%(表1)。除探針使用的GT和CT的重復(fù)序列外, 還篩選到三堿基GTT、TGG、GAA、CAA; 四堿基TCTA、ACAG、TAGA、GTGA、GTCT、GATA及五堿基TTTTG的重復(fù)序列, 具體統(tǒng)計見表2。

表1 細角螺基因組微衛(wèi)星序列的分類情況 Tab.1 Classification of microsatellites for H. ternatanus

表2 部分微衛(wèi)星序列的重復(fù)單元、重復(fù)類型及序列號情況 Tab.2 The repeat motifs, category and genebank accession number of part of microsatellite sequences

2.2 克隆測序峰圖

在測序的220個陽性克隆中, 有156個單向測序不能測通, 占所有克隆的70%, 需再用載體的反向引物來測序,才能測序成功。并且這部分的測序結(jié)果顯示, 在單個克隆中有多處微衛(wèi)星重復(fù)序列, 有的甚至高達6處, 并且出現(xiàn)復(fù)雜的堿基重復(fù)。這可能是導(dǎo)致測序過程出現(xiàn)信號衰減, 測序峰圖紊亂的原因。圖2為單向測序測通的某克隆部分峰圖。

圖2 XL46位點部分微衛(wèi)星測序峰圖 Fig. 2 Part of the microsatellite sequencing peak figure in XL46 loci

3 討論

被用于微衛(wèi)星分子標記的生物素探針有多種, 可根據(jù)研究對象的特點來選擇相應(yīng)的探針。在所有動物基因組中(CA)n微衛(wèi)星的含量最為豐富, 其次是(CT)n微衛(wèi)星[11], 故本實驗在用(GT)15探針的基礎(chǔ)上又采用了(CT)15探針, 以期獲得更多的標記位點。在真核生物基因組中, 雙核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星DNA最為豐富, 三核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星DNA比雙核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星DNA的含量低10倍, 四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星DNA與之相比, 含量更少[12]。本研究的結(jié)果顯示細角螺基因組DNA中二堿基重復(fù)的微衛(wèi)星序列(84.53%)含量最高, 這與研究報告的結(jié)論相一致, 而四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星序列(9.71%)比三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星序列(5.4%)所占的比例更高, 與報告過的研究結(jié)果相反。原因可能是雜交時采用(GT)15、(CT)15混合探針, 導(dǎo)致在總的278個微衛(wèi)星片段中出現(xiàn)多達21個GTCT以及與之相互補的CAGA重復(fù)序列。本研究獲得的細角螺微衛(wèi)星中, 完美型所占比例為61.7%, 與蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis) 50.18%[13], 企鵝珍珠貝(Pteria penguin)65.5%[14], 合浦珠母貝(Pinctada martensii)77.3%[15], 大珠母貝(Pinctada maxima)63%[7]及西施舌(Coelomactra antiquate)68.4%[16]等貝類基本相似, 都是完美型所占的比例更高, 而混合型所占的比列(9.4%)與李琪等[17]研究的長牡蠣(Crassostrea gigas)的混合型比例(24.2%)相差很大。這些不同的結(jié)果與研究方法和篩選富集得到的不同微衛(wèi)星區(qū)域有關(guān), 同時也在一定程度上反映了貝類基因組微衛(wèi)星的特性。

微衛(wèi)星核心序列突變率相對較高, 造成了微衛(wèi)星核心序列重復(fù)次數(shù)的變化, 這是微衛(wèi)星多態(tài)性的基礎(chǔ)[18]。Valdes[19]認為重復(fù)次數(shù)低于5 的微衛(wèi)星幾乎檢測不出多態(tài)性, 一般微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)程度與多態(tài)性程度成正相關(guān)[20]。本實驗所得序列重復(fù)次數(shù)多集中在7～30, 占62%, 最高達到64次。理論上講, 本研究所得的細角螺微衛(wèi)星序列中,應(yīng)該有約60%的序列可以設(shè)計的引物。但是由于一條克隆中出現(xiàn)多處微衛(wèi)星序列, 最高高達6處, 并且出現(xiàn)復(fù)雜的堿基重復(fù), 導(dǎo)致測序峰圖紊亂以及引物設(shè)計困難, 在278條序列中僅有82條可以設(shè)計引物, 并且質(zhì)量較高的僅有50條。原因可能是在富集過程中多次洗滌磁珠, 使得一個克隆里有多個重復(fù)序列片段, 保守序列堿基數(shù)少, 導(dǎo)致引物設(shè)計和篩選困難。另一個原因可能是細角螺基因組中的微衛(wèi)星本來就比較復(fù)雜, 與多數(shù)貝類遺傳背景一樣, 在進化過程中發(fā)生染色體重排[21],導(dǎo)致基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜和存在多個位點,從而對引物的設(shè)計及篩選產(chǎn)生影響。

目前國內(nèi)對細角螺的研究主要集中在幼苗繁育[1-2]及生理生化上[22], 國外主要集中在幼螺生長的生態(tài)習(xí)性[23]、神經(jīng)鞘脂類的組成和結(jié)構(gòu)[24-27]、體內(nèi)的砷分布[28], 對其遺傳多樣性的研究較少, 僅在核型特征[29]方面有所報道。本研究構(gòu)建細角螺進行微衛(wèi)星富集文庫及分析其序列組成, 為進一步篩選大量的微衛(wèi)星引物奠定基礎(chǔ), 以期為保護細角螺野生群體、開展苗種繁育, 種苗放流及良種培育等工作提供理論參考的目的。

[1] 洪國蓮．細角螺人工育苗技術(shù)[J]．福建水產(chǎn), 2010, 2: 30-32.

[2] 許章程, 金亮, 宋普慶, 等．溫度和鹽度與細角螺幼體生存、生長及發(fā)育的關(guān)系[J]. 臺灣海峽, 2009, 28(2): 266-271.

[3] 許章程, 王初升, 張玉生. 細角螺的繁殖生態(tài)條件及繁殖習(xí)性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2006, 30(6):848-851.

[4] Wang Z, Weber J L, Zhong G, et al. Survey of plant short tandem DNA repeats[J]. Theor Appl enet, 1994, 88(1): 1-6.

[5] Tautz D. Hypervariabflity of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers [J]. Nucleic AcidsResearch, 1989,17(16):6463-6467.

[6] 王家祺, 郭 豐, 丁少雄, 等. 斜帶石斑魚不同地理群體遺傳變異的微衛(wèi)星分[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(11): 60-64.

[7] 谷龍春, 黃桂菊, 何毛賢, 等. 大珠母貝兩個野生群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2009, 33(4): 96-101.

[8] 王文琪, 張 毅, 劉夢俠, 等. 鲉許氏平 4 個野生群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分[J]. 海洋科學(xué), 2012, 36(1): 10-16.

[9] Linda C, Luke R, Dan M, et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants [J]. Genetics, 2000, 156(2): 847-854.

[10] Weber J L. Informativeness of human (dC-dA)n (dG-Dt)n ploymorphisms[J]. Genomics, 1990, 7(3): 524-530.

[11] Brenner S, Elgar G, Sandford T, et a1．Characterization of thepufferfish(Fugu) genome as a compact model vertebrate genome[J]．Nature, 1993, 366: 265-268.

[12] Ma Z Q, Rder M, Sorrells M E. Frequencies and sequence characteristics of di-, tri-, and tetra-nucleotide microsatellites inwheat[J]. Genome, 1996, 39(1): 123-130.

[13] 趙瑩瑩, 朱曉琛, 孫效文, 等 . 磁珠富集法篩選蝦夷扇貝微衛(wèi)星序列[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2006, 13(5): 749-755.

[14] 許友卿, 肖群平, 李詠梅, 等. 企鵝珍珠貝微衛(wèi)星分子標記的篩選[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 32(3): 88-93.

[15] 曲妮妮, 龔世園, 黃桂菊, 等. 基于FIASCO 技術(shù)的合浦珠母貝微衛(wèi)星標記分離與篩選研究[J]. 熱帶海洋學(xué)報, 2010, 29(3): 47-54.

[16] 朱立靜, 孫中響, 沈頌東, 等. 磁珠富集法篩選西施舌微衛(wèi)星序列[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2011, 7(4): 10-15.

[17] 李琪, 木島明博. 長牡蠣(Crassostrea. gigas)微衛(wèi)星克隆快速分離及特性分析[J]. 海洋與湖沼, 2004, 35(4): 364-370.

[18] 劉志毅, 相建海. 微衛(wèi)星DNA 分子標記在海洋動物遺傳分子中的應(yīng)用[J]. 海洋科學(xué), 2001, 25(6): 11-13.

[19] Valdes A M. Allele frequencies at microsatellite loci:the stepwise mutation model revisited[J]. Genetics, 1993, 133(3): 737-749.

[20] Rico C, Ibrahim K M, Rico I, et al. Stock composition North Atlantic populations ofwhitingusing microsatellite markers [J]. Journal of Fish Biology, 1997, 51: 462-475.

[21] Wang Y, Guo X. Chromosomal rearrangement in Pectinidae revealed by rRNA loci and implications for bivalveevolution[J]. Biological Bulletin, 2004, 207(3): 247-256.

[22] 梁海鷹, 曹伏君, 張亮珠, 等. 細角螺幾種組織的同工酶分析[J]. 吉首大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2007, 28(5): 87-91.

[23] Kishineh, Hayashi A, Morita M. Sphingolipids ofHemifusus ternatanusⅣ[J]. Nihon Yuka Gakkai NenkaiKoen Yoshishu,2001, 40(1): 69.

[24] Mishima Y, Kishima H, Hayashi A. Sphingolipids ofHemifusus ternatanusCeramide Monohexosides and Ceramide Aminoethylphosphonate of the Viscera in Japanese [J]. Yukagaku, 1997, 46(1): 39-49.

[25] Hamada S. Growth and feeding ofHemifususternatanus in early crawling stage[J]. Japanese Journal of Malacology, 1974, 33(2): 75-79.

[26] Hayashia D, Kishine H. Comparative biochemical studies on lipids of gastropods(mollusca): Structures and compositions of long-chain bases of sphingolipids[J]. The Japanese Journal of Malacology, 1997, 56(2): 157-167.

[27] Kishine H, Mishima Y, Hayashi A. Structural determination of long-chain bases of ceramide aminoethylphosphonate,Hemifusus ternatanus[J].Yukagaku, 1995, 44(11): 977-984.

[28] Phillips D J, Epledgem H D. Dstribution of inorganic and total arsenicin tissues of the marine gastropodHemifusus ternatanus[J]. Marine Ecology Progress Series, 1986, 34: 261-266.

[29] 曹伏君, 李長玲, 羅杰, 等. 管角螺、細角螺的核型研究[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報, 2008, 28(1): 15-18.