蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)研究

張陣陣 欒 潔 汪家春 儲(chǔ)智勇

海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433

蟲草屬Cordyceps （Fr.）Link 是一大類昆蟲病原真菌，其特定的菌感染特定的昆蟲后才成為具有重要的藥用價(jià)值的冬蟲夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]，該屬偽品種類繁多，品質(zhì)高低各異[1]。 蟲草屬的種質(zhì)資源豐富，屬間物種的形態(tài)極其相似， 但僅有蝙蝠蛾科蟲草為 《中國(guó)藥典》2010 年版規(guī)定的冬蟲夏草。 現(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究顯示，蝙蝠蛾科蟲草對(duì)吞噬腫瘤細(xì)胞的能力是硒的4 倍，所含的蟲草素能明顯增強(qiáng)紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞的能力，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，明顯提升白細(xì)胞和血小板的數(shù)量，可輔助治療鼻咽癌、肺癌、白血病、腦癌等惡性腫瘤；減輕組織水腫，可多用于腦水腫的輔助治療， 防治急性腎功能衰竭等疾病，預(yù)防和控制慢性支氣管炎、肺源性心臟病，迅速改善放、化療后的嘔吐惡心、頭發(fā)脫落、失眠等癥狀。 另外，蝙蝠蛾科蟲草所含的特有成分蟲草多糖為免疫調(diào)節(jié)劑，臨床治療及保健用途廣泛。 在美國(guó)，因其對(duì)于惡性腫瘤預(yù)防控制的特殊貢獻(xiàn)，已將其列為抗腫瘤新藥，目前已進(jìn)入臨床三期的研究[2-3]。

因受自然條件的限制，天然蝙蝠蛾科蟲草資源日益緊缺，價(jià)格昂貴，一些不法分子利用劣質(zhì)或亞香棒蟲草代替蝙蝠蛾科蟲草， 其治療效果受到偽品及劣質(zhì)品嚴(yán)重影響，甚至對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，鑒別和評(píng)價(jià)同屬不同科的蟲草顯得尤為重要[4]。 目前，其檢測(cè)方法多為生藥學(xué)鑒定，薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等主要化學(xué)方法鑒定，分子水平鑒定也開始進(jìn)行[5-8]。

藥用真菌蟲草屬的DNA 指紋圖譜檢測(cè)方法中所采用的放射顯帶方法和熒光顯帶方法具有一定的局限性，放射顯帶方法對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員均有高污染的風(fēng)險(xiǎn)，而熒光顯帶方法所需要的儀器昂貴，難以普及。 另外，低污染而應(yīng)用普遍的傳統(tǒng)聚丙烯凝膠電泳銀染顯帶方法操作時(shí)間長(zhǎng)、步驟多，采用試劑繁多，易造成顯帶背景顏色濃、分辨率低、條帶模糊的情況，導(dǎo)致顯帶結(jié)果不準(zhǔn)確。本文分別對(duì)蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠終濃度、膠電泳步驟、膠固定方案、膠染色方法、膠顯色步驟進(jìn)行分析，確定利于蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠DNA 多態(tài)性展現(xiàn)的方案， 現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與儀器

1.1 材料

蟲草屬Cordyceps（Fr.）Link 樣品由海軍醫(yī)學(xué)研究所汪家春副研究員鑒定。 丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過(guò)硫酸胺、TEMED 購(gòu)自Takara 生物公司；尿素（Urea）購(gòu)自Sigma 公司；硝酸銀、剝離硅烷、親和硅烷購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程公司；引物、接頭由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 不同濃度聚丙烯酰胺凝膠配制情況

1.2 儀器

DYCZ-20A 型電泳槽、DYY-12 型電泳儀電源（北京六一儀器廠），P270 型搖床 （中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠），PCR 儀 （德國(guó)Biometra 公司），DK-S12 型電熱恒溫水浴鍋（上海華連醫(yī)療器械有限公司），高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），PL3002 型電子天平（METTLER TOLEDO 公司）。

2 方法

2.1 配制緩沖液及常用試劑

2.1.1 TE 緩沖液的配制 用pH 8.0 為10 mmol/L Tris-HCl及1 mmol/L EDTA 配制，配制溶液高壓滅菌后室溫保存。

2.1.2 5×TBE 緩沖液的配制 在800 mL 雙蒸水中加入Tris、硼酸和pH 為8.0 的EDTA，定容至1 L 后室溫保存。

2.1.3 1 mmol/L Tris-HCl 的配制 在雙蒸水中加入Tris-HCl，雙蒸水取800 mL，用濃HCL 的劑量調(diào)節(jié)pH 值，定容至1 L 后室溫保存。

2.1.4 5 mol/L EDTA 的配制 稱取186.1 g 乙二胺四乙酸二鈉鹽·2H2O 溶于800 mL 雙蒸水， 用NaOH 的劑量調(diào)節(jié)pH 值，調(diào)至pH 8.0，定容至1L 后室溫保存。

2.1.5 變性上樣緩沖液的配制 在98 mL 去離子甲酰胺溶液中加入2 mL EDTA 溶液，EDTA 溶液為pH 8.0， 再分別加入50 mg 溴酚蘭和50 mg 二甲苯氰。

2.1.6 40%丙烯酰胺儲(chǔ)液（19∶1）的配制 50 mL H2O 中加入丙烯酰胺和2 g N，N′-亞甲叉雙丙烯酰胺， 加熱到37℃使之溶解，用定性濾紙過(guò)濾定容至1 L 后，棕色瓶里4℃保存。

2.1.7 顯影液及染色液的配制 將60 g 碳酸鈉加入2 L 的雙蒸水中，放入冰箱4℃保存，在顯色時(shí)即刻加入甲醛溶液和硫代硫酸鈉溶液，震蕩均勻后配制成顯色液；在1 L 的雙蒸水中加入硝酸銀和甲醛溶液，充分溶解后配制成染色液。

2.1.8 不同比例硝酸銀溶液的配制 1 L 所配制的染色液中分別加入1、2、3、4 g 的硝酸銀，配制成濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的溶液。

2.2 測(cè)序凝膠板的制備

分別用親和硅烷溶液和浸透剝離硅烷處理相應(yīng)的測(cè)序凝膠板，建立黏附和分離功能的測(cè)序凝膠板。

2.3 凝膠的制備

先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入丙烯酰胺和N，N’-亞甲叉雙丙烯酰胺混合溶液 （Acr&Bis） 溶液和10×硼酸（TBE）緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至99.2 mL，并用0.45 mm的濾膜過(guò)濾， 然后再加過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺（TEMED）。 表1 為配制3%～6%不同聚丙烯酰胺凝膠濃度所 需 尿 素、Acr&Bis、10×TBE 緩 沖 液、10%過(guò) 硫 酸 銨、TEMED、雙蒸水的配方。

2.4 測(cè)序凝膠銀染顯色步驟

2.4.1 膠固定 將聚丙烯酰胺凝膠板放入容器中，用配制號(hào)的固定溶液浸沒(méi)，用搖床振蕩至標(biāo)記樣品的染色帶小時(shí)。

2.4.2 膠染色 將固定好的聚丙烯酰胺凝膠分離，對(duì)出現(xiàn)分子指紋顯色的聚丙烯酰胺凝膠板進(jìn)行漂洗， 時(shí)間控制在6 s以內(nèi)，漂洗好后即刻放入配好的染色液中進(jìn)行染色，搖床充分震蕩15 min。

2.4.3 膠清洗 用雙蒸水充分清洗， 具體方法為振蕩洗膠3次，每次5 min。

2.4.4 膠染色終止 終止顯色反應(yīng)，將聚丙烯酰胺凝膠放入終止液中，固定凝膠并干膠。

3 結(jié)果

3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%時(shí)， 分子遷移率和多態(tài)性均符合蟲草屬分子的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)需要，見圖1。銀染中膠顯色步驟中顯影液為強(qiáng)堿NaOH 和0.5%的甲醛溶液，且NaOH 的濃度為2%。

圖1 部分蟲草屬樣品6%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染圖

3.2 不同Ag+濃度對(duì)蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態(tài)性顯示的影響

由表2 可見，蟲草屬DNA 在0.3%Ag+濃度的聚丙烯酰胺凝膠多態(tài)性最佳，多態(tài)性條帶數(shù)達(dá)到80 以上，且染色背景清晰。

表2 不同Ag+濃度對(duì)蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態(tài)性顯示的影響

表3 常見幾種方法對(duì)蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態(tài)性顯示的影響

3.3 常見幾種方法對(duì)蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態(tài)性顯示的影響

由表3 可見， 蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)采用方法3，即固定、染色、顯色三步時(shí)聚丙烯酰胺凝膠多態(tài)性顯示最佳，且節(jié)約染色時(shí)間，操作及保存方式簡(jiǎn)單。

4 討論

中藥材的真假、質(zhì)量的好壞，會(huì)直接影響臨床應(yīng)用的效果和患者的生命安全，對(duì)此，李時(shí)珍早就有“一物有謬，便性命及之”的名言。 所以對(duì)于中藥材的鑒別有著十分重要的意義。 中藥材的鑒別方法有很多，通?？煞譃閷?duì)植物自然形態(tài)的鑒別，對(duì)炮制藥材外表性狀的鑒別，用顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)的鑒別，以及化學(xué)分析、生物測(cè)定等鑒別方法。 近年對(duì)中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法進(jìn)展很快，有用藥效學(xué)、免疫活性以及化學(xué)模式識(shí)別結(jié)合藥效學(xué)、DNA 指紋圖譜等方法評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量[9]。 DNA 指紋圖譜技術(shù)是以生物基因組DNA 序列多樣性為基礎(chǔ)，研究不同物種間遺傳差異的一項(xiàng)技術(shù)。 生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中由于各種原因，在基因組水平上產(chǎn)生了廣泛的變異，在物種間甚至個(gè)體間產(chǎn)生了高度多態(tài)性， 這種多態(tài)性不因組織器官和個(gè)體發(fā)育而改變，可以通過(guò)對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)或片斷的考查檢出，通過(guò)多態(tài)性圖譜的形式表現(xiàn)出來(lái)。 我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化是中藥現(xiàn)代化的必由之路，中藥材品質(zhì)鑒定是中藥質(zhì)量控制的首要環(huán)節(jié)，尋找科學(xué)有效的鑒定方法是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化迫切任務(wù)。 特別是近年來(lái)藥用蟲草的研究和應(yīng)用很廣，受利益驅(qū)使，一些不法分子利用劣質(zhì)或亞香棒蟲草代替蝙蝠蛾科蟲草，因此對(duì)蟲草屬的鑒別和品質(zhì)鑒定尤顯重要[10-12]。

本文所采取的蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法所采取的銀染法，是利用銀離子可與核苷酸結(jié)合的特性，甲醛能使銀離子在堿性環(huán)境下還原，從而顯現(xiàn)蟲草屬聚丙烯酰胺凝膠中的DNA 指紋片段。 與同位素檢測(cè)顯帶相比較，其靈敏度雖低于同位素，但完全可達(dá)到檢測(cè)要求，避免了同位素的危害。 聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色既可避免接觸誘變劑（溴化乙錠），也可免受同位素的輻射，實(shí)用性強(qiáng)[13]。與熒光染色檢測(cè)方法相比，解決了熒光染色檢測(cè)方法費(fèi)用高額的矛盾，易推廣普及。 另外，與傳統(tǒng)的四步法（固定、染色、顯色、終止）相比較，節(jié)省了時(shí)間，提高了效率；同時(shí)，與二步法（合并固定于染色為一個(gè)步驟的方法）相比較，該方法能檢測(cè)到蟲草屬小分子量的多態(tài)性，得到了高分辨率的蟲草屬DNA 指紋。 因此，各個(gè)物種分子多態(tài)性分布不同，需要進(jìn)行特定性條件的摸索，以建立適合的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染條件和方法。

蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法具體實(shí)驗(yàn)操作中還有以下體會(huì)： ①凝膠測(cè)序板的制備需要單向處理，不可擦拭太過(guò)用力，否則會(huì)導(dǎo)致玻璃硅烷蒸發(fā)，造成聚丙烯酰胺凝膠脫落于測(cè)序版；制備測(cè)序板時(shí)，兩種處理溶劑玻璃硅烷和親和硅烷要戴不同手套處理，嚴(yán)謹(jǐn)敷料的交叉污染，避免聚丙烯酰胺凝膠撕裂；測(cè)序板上的殘留聚丙烯酰胺不要用刀片刮去， 以免劃傷， 用10% NaOH 浸泡30 min 后除去即可。 ②在凝膠制備過(guò)程中，需要溶解的尿素不可加熱溫度過(guò)高。 如果確需加熱則應(yīng)等溶液完全冷卻后，再可加入TEMED 和過(guò)硫酸銨；灌制凝膠的過(guò)程中要方式微小氣泡的產(chǎn)生，確保聚丙烯酰胺光滑無(wú)氣泡，才可以保證測(cè)序結(jié)果的可靠性。

總之，筆者研究表明，需根據(jù)每個(gè)物種分別摸索條件，才可以得到穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、特異性強(qiáng)的結(jié)果。 本研究建立了蟲草屬聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的方法，為蟲草屬植物的鑒定及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究技術(shù)平臺(tái)的建立奠定了基礎(chǔ)。

[1] 張陣陣，汪家春，儲(chǔ)智勇.冬蟲夏草cDNA-AFLP 銀染法顯帶研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（3）：1-4.

[2] Illana EC. Cordyceps sinensis， a fungi use d in the Chinese traditional medicine[J]. Rev Iberoam Micol，2007，24（4）：259-262.

[3] Zhu JS， Halpem GM，Jones K. The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine： Cordyceps sinensis [J]. J Altern Complement Med，1998，4（3）：289.

[4] Li SP， Yang FQ， Tsim KW. Quality control of Cordyceps sinensis， a valued traditional Chinese medicine [J].J Pharm Biomed Anal，2006，41（5）：1571-1584.

[5] 雷寧，杜樹山，倪雪梅，等.RP-HPLC 測(cè)定天然蟲草與人工蟲草中核苷類成分的含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，6（4）：948-951.

[6] 吳洪臻，董新紅，馬德恩，等.冬蟲夏草及其代用品有效成分比較[J].中草藥，2000，31（8）：576-579.

[7] 李紹平，李萍，季暉，等.天然與發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中核苷類成分的含量及其變化[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36（6）：436-438.

[8] Yu L， Zhao J， Li SP， et al. Quality evaluation of Cordyceps through simultaneous determination of eleven nucleosides and bases by RPHPLC[J]. J Sep Sci，2006，29（7）：953-958.

[9] 張陣陣， 汪家春， 儲(chǔ)智勇. 冬蟲夏草及其常見偽品的鑒別分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊， 2009，11（7）：1244-1253.

[10] 張陣陣，汪家春，儲(chǔ)智勇. 冬蟲夏草DNA 指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中華保健醫(yī)學(xué)雜志，2010，12（6）：490-492

[11] Bonin A， Pompanon F， Taberl，et al. Use of amplified fragment length polymorphism （AFLP） markers in surveys of vertebrate diversity[J]. Methods Enzymol， 2005，395（5）： 145-161.

[12] 雷呈祥，張陣陣. 冬蟲夏草的遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2009，18（123）：12-13

[13] 許紹斌，陶玉芬，楊昭慶，等.簡(jiǎn)單快速的DNA 銀染和膠保存方法[J].遺傳，2002，24（3）：335-336.