咪達(dá)唑侖通過下調(diào)p300 抑制人咽鱗癌FaDu 細(xì)胞增殖

竇云凌， 陳 禎， 許靜紅， 江 楠， 舒海華

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州510080)

頭頸部腫瘤發(fā)病率在惡性腫瘤中占第6 位，90%以上為鱗狀細(xì)胞癌［1］，它的生長速度和侵襲性都很高，但發(fā)病機(jī)制并不清楚。已報(bào)道的可能機(jī)制有:表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)信號通路過度激活而誘導(dǎo)癌基因的表達(dá)［2］;抑癌基因如p27［3］、p16［4］及脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad protein，F(xiàn)HIT)［5］被抑制而導(dǎo)致咽鱗癌發(fā)生等。咽鱗癌的治療仍以常規(guī)的手術(shù)治療和放化療為主，效果并不理想，5 年生存率不高［6-7］。臨床上正在嘗試采用新的手段對咽鱗癌進(jìn)行治療，已報(bào)道的有分子靶向治療、基因治療、免疫治療、微創(chuàng)治療和干擾素治療等。這些新的手段已為頭頸部腫瘤治療帶來了新希望，然而，絕大多數(shù)的新治療方法尚處在實(shí)驗(yàn)室或臨床試驗(yàn)階段，要成為常規(guī)治療手段尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證和評價(jià)。因而，尋找咽鱗癌治療的新方法及策略仍是目前研究的熱點(diǎn)。

咪達(dá)唑侖(midazolam)是臨床上廣泛應(yīng)用于手術(shù)麻醉的苯二氮卓類藥物［8-9］，其作用的主要靶器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具備極好的穿透血腦屏障的能力。臨床作用主要包括:抗焦慮，作為術(shù)前用藥廣泛使用;鎮(zhèn)靜，用于術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后ICU 鎮(zhèn)靜;抗驚厥，用于局部麻醉藥中毒和癲癇發(fā)作的一線用藥;肌肉松弛作用，包括經(jīng)脊髓介導(dǎo)的骨骼肌松弛作用和作用于平滑肌而產(chǎn)生的血管擴(kuò)張作用。除了以上提到的藥物作用，在該藥使用的過程中還會產(chǎn)生順行性遺忘作用。此外，研究表明咪達(dá)唑侖還可以通過抑制炎癥反應(yīng)通路抑制免疫反應(yīng)產(chǎn)生中樞保護(hù)作用。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖能抑制咽鱗癌FaDu 細(xì)胞增殖，但具體機(jī)制仍未闡明［10］。本研究旨在探討咪達(dá)唑侖抑制人咽鱗癌FaDu 細(xì)胞增殖的機(jī)制，為咪達(dá)唑侖用于咽鱗癌治療提供理論依據(jù)和思路。

材 料 和 方 法

1 材料

人咽鱗癌細(xì)胞FaDu 從中國細(xì)胞庫購買;咪達(dá)唑侖購于江蘇恩華醫(yī)藥公司;DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購自Invitrogen;MTT 及DMSO 細(xì)胞購自Sigma-Aldrich;6 孔培養(yǎng)板、24 孔培養(yǎng)板及96 孔培養(yǎng)板購自Corning;BrdU 摻入細(xì)胞增殖試劑盒購自Promega;視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)抗體、p-Rb 抗體、p21 抗體、p27 抗體及微管蛋白(tubulin)抗體購自Cell Signaling Technology;p300 抗體購于Abcam;p300 PCR 引物由上海Invitrogen 合成;siRNA片段由上海吉瑪生物有限公司合成;蛋白定量及ECL 試劑盒購于廣州永諾生物科技有限公司。

2 方法

2.1 FaDu 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 FaDu 細(xì)胞在含10%FBS 、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基于5 % CO2、37 ℃恒溫密閉式孵箱(相對濕度95%)內(nèi)培養(yǎng)傳代，倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2 ～4 d 傳代1 次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞活性檢測( MTT 法) 對數(shù)生長期FaDu細(xì)胞(3 ×107/L)細(xì)胞懸液接種在96 孔板，咪達(dá)唑侖處理后每孔加入MTT 10 μL(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，加入DMSO 100 μL/well 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于波長570 nm 檢測吸光度(A)。

2.3 RT-PCR 檢測 采用Trizol 法提取細(xì)胞mRNA，采用試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。p300 上游引物5'-AATCCTTTCCATACCGAACC-3'，下游引物5'-GAGGGCAGTCAGAGCCATAC-3';按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增:94 ℃5 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃45 s，24個(gè)循環(huán);72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物為108 bp;β-actin 上游引物5'-GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，下游引物5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'，按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增:94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，18 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物為160 bp。產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳分析。

2.4 沉默p300 根據(jù)公認(rèn)的設(shè)計(jì)原則，確定p300干擾序列。si-p300-1:5’-GCAATGGACAAGGGATAAT-3’;si-p300-2:5’-GCAGCTCAACCATCCACTA-3’。合成以上片段，采用Lipofectamine 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，片段量為100 pmol/well，轉(zhuǎn)染時(shí)間為72 h。

2.5 Western blotting 將FaDu 細(xì)胞種植在6 孔培養(yǎng)板，咪達(dá)唑侖處理后200 μL 裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液至1.5 mL EP 管，采用Bradford 方法進(jìn)行蛋白定量，煮沸樣本5 min，冰上冷卻后10 000 ×g離心30 s，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，然后100 V 轉(zhuǎn)膜1 h，0.5%(W/V)脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，4 ℃Ⅰ抗孵育過夜，0.1%(V/V)TBST 洗膜2 次后，室溫孵育Ⅱ抗1 h ，洗膜3 次后即用ECL 顯色曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用方差分析，應(yīng)用SPSS 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié) 果

1 咪達(dá)唑侖抑制FaDu 細(xì)胞的增殖

相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):對照組FaDu 細(xì)胞單層貼壁生長，排列密集，呈島嶼狀分布，細(xì)胞呈橢圓形或多邊形;而咪達(dá)唑侖處理組，數(shù)量明顯減少，胞體較對照組細(xì)胞縮小，呈長梭形，見圖1A，表明咪達(dá)唑侖可使人咽鱗癌FaDu 細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。不同濃度(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)咪達(dá)唑侖處理FaDu 細(xì)胞24 h 或48 h 后進(jìn)行MTT 檢測，結(jié)果顯示，50 μmol/L 咪達(dá)唑侖處理24 h 開始抑制FaDu 細(xì)胞的增殖;而6.25 μmol/L 咪達(dá)唑侖處理48 h 即可觀察到對FaDu 細(xì)胞的抑制作用，見圖1B，表明咪達(dá)唑侖呈時(shí)間和劑量依賴性地降低FaDu 細(xì)胞的活性。BrdU 摻入檢測結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖呈濃度依賴性地抑制FaDu 細(xì)胞增殖能力，見圖1C。

Figure 1. Midazolam inhibited the viability and proliferation of FaDu cells. A:phase-contrast images of cells treated with 0 (control)and 100 μmol/L midazolam for 48 h(×200);B:dose-and time-dependent effect of midazolam on cell viability detected by MTT assay;C:effect of midazolam on cell proliferation detected by BrdU incorporation assay. Mean ± SD. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 咪達(dá)唑侖抑制FaDu 細(xì)胞增殖

2 咪達(dá)唑侖抑制p300 的表達(dá)

不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)咪達(dá)唑侖處理FaDu 細(xì)胞48 h 后，與對照組比較，咪達(dá)唑侖呈濃度依賴性地抑制p300 mRNA 及蛋白的表達(dá)，見圖2。

3 沉默p300 抑制咽鱗癌FaDu 細(xì)胞增殖

Figure 2. Dose-dependent effect of midazolam on p300 mRNA(A)and protein (B)expression in FaDu cells detected by RT-PCR and Western blotting，respectively.FaDu cells were incubated with 0，25，50 and 100 μmol/L midazolam for 48 h. Mean ± SD. n =3. * P＜0.05 vs control (0 μmol/L).圖2 咪達(dá)唑侖抑制p300 的表達(dá)

與對照組比較，轉(zhuǎn)染p300干擾片段后，p300 mRNA 及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明沉默p300 成功，見圖3A、B;MTT 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，沉默p300 (si-p300-1 及si-p300-2 處理)后FaDu 細(xì)胞活性明顯減弱，見圖3C;BrdU 摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默p300 抑制FaDu 細(xì)胞增殖，見圖3D。

Figure 3. Knockdown of p300 inhibited the viability and proliferation of FaDu cells. A:p300 mRNA expression detected by RT-PCR;B:p300 protein expression detected by Western blotting;C:cell viability tested by MTT assay;D:cell proliferation measured by BrdU incorporation assay. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs scrambled.圖3 沉默p300 可抑制FaDu 細(xì)胞增殖

4 p300 沉默通過細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI)/Rb 通路抑制FaDu 細(xì)胞增殖

FaDu 細(xì)胞轉(zhuǎn)染p300 干擾片段(si-p300-1 及sip300-2)及對照組片段(scrambed)，72 h 后Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)，沉默p300 后CDK 抑制蛋白p21及p27 水平上調(diào)，而Rb 磷酸化水平則明顯下調(diào)，見圖4。以上結(jié)果表明，p300 沉默可能通過CDKI/Rb通路抑制FaDu 細(xì)胞增殖。

討 論

p300 是轉(zhuǎn)錄激活組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的一員，p300 在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮多種作用，催化組蛋白乙?；M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性［11-12］。p300 參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和DNA 損傷反應(yīng)［13］。有報(bào)道p300 在某些人類惡性腫瘤起到了抑癌作用，包括乳腺癌、腸癌和胃癌［14-15］。然而，最近的研究表明，p300 可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生［16-18］。p300 可作為輔助因子參與調(diào)控p53和低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)水平，從而促進(jìn)浸潤性乳腺癌發(fā)生［19］;p300 的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌的生長，可作為預(yù)測前列腺癌癥的標(biāo)記物［20］;p300 也是頭頸部鱗癌的關(guān)鍵因子，沉默p300 可以抑制腫瘤生長［21］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖下調(diào)p300 而抑制人咽鱗癌FaDu 細(xì)胞增殖，且其機(jī)制可能是通過抑制CDKI/Rb 通路，這與目前p300 在其它腫瘤中的功能報(bào)道是一致的，這可為咽鱗癌的治療提供新的參考。

腫瘤的手術(shù)切除是治療癌癥最有效、最直接的治療手段。然而，圍手術(shù)期是腫瘤轉(zhuǎn)移最為敏感的時(shí)期，一方面是由于手術(shù)過程中癌細(xì)胞的游離以及手術(shù)導(dǎo)致的免疫功能抑制所致，另一方面圍手術(shù)期的麻醉處理會影響經(jīng)受手術(shù)治療病人的預(yù)后。一些麻醉藥物包括氯胺酮、戊硫代巴比妥和氟烷，能抑制自然殺傷細(xì)胞的活性并且促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移;阿片類藥物可抑制人免疫系統(tǒng)的功能［22］;嗎啡也被證實(shí)具有在體內(nèi)外刺激人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖能夠抑制人咽鱗癌細(xì)胞FaDu 細(xì)胞的生長和增殖，因此手術(shù)中應(yīng)用具有腫瘤抑制作用的麻醉藥(例如咪達(dá)唑侖)將為腫瘤病人提供更多的保護(hù)。

Figure 4. Knockdown of p300 inhibited the proliferation of FaDu cells via CDKI/Rb pathway. The protein expression of p21，p27，Rb and p-Rb was detected by Western blotting 72 h after siRNA transfection. Tubulin was used as a loading control. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vsscrambled.圖4 p300 沉默通過CDKI/Rb 通路抑制FaDu 細(xì)胞增殖

我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明咪達(dá)唑侖抑制增殖不依賴于苯二氮卓受體激活［10］，那么咪達(dá)唑侖下調(diào)p300 的具體機(jī)制是怎樣的?已知苯二氮卓類麻醉藥(包括咪達(dá)唑侖)可靶向一些蛋白［如BET(bromodomain and extra-terminal)蛋白家族中的bromodomain］而抑制蛋白相互作用［23］，p300 蛋白中也含有bromodomain，苯二氮卓類化合物可抑制蛋白p53與MDM2(murine double minute 2)相互作用已有證明［24］，而p300 可與CITED2(CBP/p300-interacting transactivator with ED-rich tail 2)蛋白相互作用而影響后者在一些細(xì)胞周期控制相關(guān)基因表達(dá)中起作用［25］。咪達(dá)唑侖是否通過影響p300 與CITED2 結(jié)合而調(diào)控FaDu 細(xì)胞增殖需進(jìn)一步證實(shí)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖是通過下調(diào)p300 表達(dá)而抑制FaDu 細(xì)胞增殖，提示p300 在咽鱗癌的發(fā)生中起重要作用，那么在咽鱗癌中p300 是否表達(dá)上調(diào)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?？傊?，通過本研究，我們?yōu)檠树[癌的治療提供了新的線索和思路，同時(shí)也為將咪達(dá)唑侖開發(fā)或改造為高效的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

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