美托洛爾對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞磷酸化縫隙連接蛋白43 表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡的影響*

梁 慶， 李自成， 鄺素華， 黃偉青， 黃敏堅(jiān)， 林俊敏， 梁子敬

(1暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州510632;廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2急診科，3心臟外科，廣東 廣州510120)

連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是心臟中表達(dá)最豐富的連接蛋白，其構(gòu)成的間隙連接(gap junction，GJ)通道在心肌細(xì)胞中的電耦聯(lián)及化學(xué)信息交流中起著非常重要的作用。近期，Salameh 等［1］的研究發(fā)現(xiàn)美托洛爾(metoprolol，Meto)不同異構(gòu)體均能阻止GJ通道Cx43 的降解而上調(diào)離體乳鼠心肌細(xì)胞GJ 通道Cx43 表達(dá)。Cx43 的磷酸化與去磷酸化對(duì)GJ 通道的功能有著非常重要的調(diào)控作用。β 腎上腺素受體阻滯劑可對(duì)抗心力衰竭(heart failure，HF)時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌的長(zhǎng)期持續(xù)激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而其內(nèi)在機(jī)制是否與Cx43 表達(dá)及磷酸化調(diào)控相關(guān)，目前仍不清楚。本文觀察Meto 對(duì)心力衰竭大鼠在體心肌細(xì)胞磷酸化Cx43(phosphorylated connexin 43，p-Cx43)表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡影響，并探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 心力衰竭模型的復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠100 只，體重180 ～200 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)為0096235)。動(dòng)物隨機(jī)化分為5 組:(1)假手術(shù)組(sham，n=20);(2)心力衰竭模型組(HF，n =20);(3)美托洛爾治療低劑量組(MetoA，n =20);(4)美托洛爾治療中劑量組(MetoB，n =20);(5)美托洛爾治療高劑量組(MetoC，n =20)。施行腹主動(dòng)脈次全結(jié)扎術(shù)，將7 號(hào)注射針頭(去尖)與大鼠左腎動(dòng)脈上方1.0 ～1.5 cm 處的腹主動(dòng)脈緊貼并共同結(jié)扎后抽出針頭，造成腹主動(dòng)脈狹窄70% ～80%，從而建立壓力負(fù)荷型心力衰竭動(dòng)物模型，sham 組不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，其余操作同模型組。大鼠術(shù)后喂養(yǎng)8 周，美托洛爾治療組大鼠術(shù)后第4 周開始每日分2 次灌胃給藥(酒石酸美托洛爾片，阿斯利康制藥有限公司)(日劑量:MetoA 組1.25 mg·kg-1·d-1;MetoB 組5 mg·kg-1·d-1;MetoC 組20 mg·kg-1·d-1)，sham 組和HF 組正常喂養(yǎng)。術(shù)后4 周及8 周行心臟超聲心動(dòng)圖測(cè)定心功能，術(shù)后8 周測(cè)定心功能后取大鼠心臟進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。大鼠的處置符合暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)管理規(guī)定。

2 常規(guī)心電圖和心臟超聲心動(dòng)圖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

術(shù)后第4 周及第8 周用6 ～12 MHZ 高頻線陣探頭取各組大鼠胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面及腹主動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面連續(xù)檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)，舒張末期室間隔厚度(interventricular septal diastolic thickness，IVSd)和左室后壁厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness，LVPWd)及左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。所有超聲心動(dòng)圖檢查均由一位具有豐富超聲心動(dòng)圖檢查經(jīng)驗(yàn)的心臟?？漆t(yī)生完成。造模術(shù)前與術(shù)后4 周、8 周常規(guī)心電監(jiān)測(cè)。

3 大鼠心臟取材

大鼠術(shù)后8 周檢測(cè)心功能后，立即開胸取出心臟，置冰上去除心耳心房，平行于房室溝于左室長(zhǎng)軸中點(diǎn)處將心室分為心尖部和心底部，心尖部用于Western blotting 檢測(cè);心底部用4%多聚甲醛固定12 h 后，石蠟包埋，切片后HE 和Masson 染色觀察心臟結(jié)構(gòu)改變及膠原纖維增生情況，末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。

4 Western blotting 半定量檢測(cè)p-Cx43 表達(dá)

冰上提取大鼠心尖部左心室總蛋白后測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，每孔加入50 μg 總蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS -PAGE(10%分離膠)電泳，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。1∶400 p-Cx43 兔抗鼠多克隆抗體(購(gòu)自Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，以GAPDH(1∶2 000)抗體作內(nèi)參照。洗膜后ECL 試劑顯影。

5 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

采用TUNEL 檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司)檢測(cè)各組大鼠心肌組織中的凋亡細(xì)胞。光鏡下正常細(xì)胞核顯藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一棕黃色(TUNEL 陽(yáng)性)。每只大鼠觀察4 張切片，每張切片上隨機(jī)選取計(jì)數(shù)5 個(gè)視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)占總細(xì)胞總數(shù)百分比，取其平均值為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD 法，方差不齊采用Games-Howell 法;變量間的相關(guān)性作Pearson 直線相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 美托洛爾對(duì)心功能的影響

各實(shí)驗(yàn)組術(shù)中無大鼠死亡，腹主動(dòng)脈次全結(jié)扎術(shù)后喂養(yǎng)8 周，各組大鼠存活只數(shù)如下:(1)sham 組18 只;(2)HF 組14 只;(3)MetoA 組16 只;(4)MetoB 組18 只;(5)MetoC 組15 只，見表1。

從表1 中可見，在第8 周(給藥4 周后)，與sham組相比，HF 組及Meto 治療組的心率均有減慢(P ＜0.01);而與HF 組相比，MetoA 組的心率無明顯減慢(P ＞0.05)，MetoB 組(P ＜0.05)及MetoC 組(P ＜0.01)顯著減緩心衰大鼠心率，Meto 治療組間比較有顯著差異。HF 組和Meto 治療組的LVIDd 較sham組明顯增大，Meto 治療組的LVIDd 較HF 組顯著縮小。Meto 治療組間進(jìn)一步比較顯示，中劑量MetoB組LVIDd 較小劑量MetoA 組進(jìn)一步縮小(P ＜0.05)，而大劑量MetoC 組較中劑量組LVIDd 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。HF 組及Meto 治療組的IVSd 和LVPWd 較sham 組明顯增厚，Meto 治療組的IVSd 和LVPWd 均較HF 組顯著減小，Meto 治療組間比較顯示，中劑量組IVSd 和LVPWd 較小劑量組進(jìn)一步減小(P ＜0.05)，而大劑量組IVSd 和LVPWd 較中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。與sham 組相比，HF 組EF 為(44.71 ±9.68)%，心功能明顯惡化(P ＜0.01);MetoA 組及MetoB 組的心功能較HF組顯著改善(P ＜0.01)，而MetoC 組心功能較HF 組無明顯改善(P ＞0.05)。從上述結(jié)果可見本實(shí)驗(yàn)壓力負(fù)荷型心力衰竭大鼠建模成功，心肌出現(xiàn)不同程度的肥厚、重塑等結(jié)構(gòu)改變，且心功能惡化明顯;與HF 組比較，經(jīng)中、小劑量Meto 治療后大鼠心臟LVIDd 縮小，IVSd 和LVPWd 增厚減輕，心功能改善明顯，而大劑量Meto 治療顯著減緩心衰大鼠心率，心功能較HF 組無明顯改善，且大劑量組較中劑量組LVIDd 縮小及IVSd 和LVPWd 增厚程度均無顯著差異，顯示美托洛爾治療對(duì)心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)改變有“天花板效應(yīng)”。

表1 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較Table 1. Rat cardiac structure and hemodynamic indicators in various groups (Mean±SD)

2 心肌病理結(jié)果

HE 染色(圖1)可見，sham 組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)無增生。而HF 組心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞肥大明顯，心肌間質(zhì)增生明顯，部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性、細(xì)胞溶解及出現(xiàn)纖維化并呈現(xiàn)波浪狀，排列紊亂，局部斷裂，有出血和炎癥表現(xiàn)，進(jìn)一步Masson 染色(圖2)顯示心肌膠原纖維(標(biāo)示為藍(lán)色部分)增生明顯。而HE 染色(圖1)可見各Meto 治療組缺血區(qū)心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、空泡樣變性、細(xì)胞溶解及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較HF 組改善明顯，且隨劑量增加心肌細(xì)胞病理改變有進(jìn)一步改善。Masson 染色(圖2)亦顯示隨Meto 治療劑量的增加心肌膠原纖維增生得到進(jìn)一步抑制。上述病理表現(xiàn)提示美托洛爾治療對(duì)于心肌重塑改變的逆轉(zhuǎn)有“劑量依賴效應(yīng)”，在治療劑量范圍內(nèi)劑量的增加可有效逆轉(zhuǎn)心力衰竭時(shí)心肌肥大、壞死、纖維化，以及心肌胞外間質(zhì)、膠原纖維網(wǎng)的增生。

Figure 1. Myocardial HE staining in various groups (×200).A:sham group;B:HF group;C:MetoA group;D:MetoB group;E:MetoC group.圖1 各組大鼠心肌HE 染色

Figure 2. Myocardial Masson staining in various groups (×200).A:sham group;B:HF group;C:MetoA group;D:MetoB group;E:MetoC group.圖2 各組大鼠心肌Masson 染色

3 Western blotting 結(jié)果

圖3 顯示，在分子量43 kD 處可見p-Cx43 清晰的表達(dá)條帶。HF 組p-Cx43 條帶較sham 組明顯增粗，予Meto 治療后p-Cx43 條帶隨治療劑量的增加而變細(xì)變淡。進(jìn)一步半定量分析顯示，HF 組中p-Cx43表達(dá)量較sham 組顯著升高(P ＜0.01)，而Meto 各治療組較HF 組p-Cx43 表達(dá)量均顯著降低(MetoA vs HF，P ＜0.05;MetoB vs HF，P ＜0.01;MetoC vs HF，P ＜0.01)，Meto 各治療組間兩兩比較亦有顯著差異(P ＜0.01)。

4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化

大鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化如下:sham 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(4.62 ±1.60)%;HF 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(51. 17 ±6. 94)%，較sham 組明顯升高(P ＜0.01);MetoA 組凋亡指數(shù)為(40.60 ±4.15)%，MetoB 組凋亡指數(shù)為(30.66 ±4.00)%，MetoC 組凋亡指數(shù)為(22. 24 ±5. 69)%，均較HF 組顯著下降(P ＜0.01)，Meto 各治療組間兩兩比較亦有顯著差異(P ＜0.01)，見圖4。

5 大鼠心肌細(xì)胞p-Cx43 表達(dá)程度與凋亡水平的相關(guān)性分析

Figure 3. Expression of phosphorylated connexin 43 (p-Cx43)in rat left ventricle in various groups detected by Western blotting. Mean ± SD. ＊＊ P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs HF group.圖3 各組大鼠左心室磷酸化connexin 43 蛋白的表達(dá)水平

Pearson 直線相關(guān)分析顯示，吸光度比值(p-Cx43/GAPDH)與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈明顯的正相關(guān)(r=0.905，P ＜0.01)，見圖5。

Figure 4. Myocardial tissue TUNEL staining (×400)and apoptotic index in various groups. A:sham group;B:HF group;C:MetoA group;D:MetoB group;E:MetoC group. Mean ±SD. ＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs HF group.圖4 各組心肌組織TUNEL 染色和凋亡指數(shù)

Figure 5. The expression of p-Cx43 and myocardial apoptotic index were positively correlated.圖5 p-Cx43 的表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析

討 論

HF 患者中神經(jīng)體液的一個(gè)主要特點(diǎn)是神經(jīng)內(nèi)分泌的長(zhǎng)期持續(xù)激活，特別是交感神經(jīng)興奮及血漿中去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)水平的升高及尿中兒茶酚胺排泄的增加，而NE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是HF 發(fā)生的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制［2-3］。因此通過抑制NE 的心臟毒性從而抑制心肌細(xì)胞凋亡給HF 的治療帶來新希望，而已知β 腎上腺素受體阻滯劑可對(duì)抗HF 動(dòng)物模型或患者中神經(jīng)內(nèi)分泌的長(zhǎng)期持續(xù)激活誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡這一效應(yīng)［4-5］。且大量動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)無論在缺血缺氧前或缺血缺氧中施加GJ通道的阻斷劑，均可顯著限制心肌梗死的范圍和面積［6］。

GJ 通道的基本結(jié)構(gòu)單位是連接小體(connexon)，由6 個(gè)Cx 圍成，小體中央形成直徑1.5 nm 的親水管道(hydrophilic channel)，即為Cx 半通道。相鄰細(xì)胞間的Cx 半通道對(duì)接而組成完整GJ 通道。Cx構(gòu)成的心臟GJ 通道是心肌細(xì)胞間通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，分子量小于1 kD、直徑小于1.5 nm 的多種物質(zhì)如代謝物、離子、第二信使、水分子等都可通過，并可在電興奮組織中傳導(dǎo)電沖動(dòng)。Cx43 是心臟中表達(dá)最豐富的Cx，其構(gòu)成的GJ 通道在心肌細(xì)胞中的電偶聯(lián)及化學(xué)信息交流(GJ 通道介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊)中起著非常重要的作用［7］。Cx43 的磷酸化與去磷酸化對(duì)GJ通道的功能有著非常重要的影響作用［8］。我們前期的研究表明Cx43 的羧基末端241 ～382 為主要的磷酸化區(qū)，也是多種激素的識(shí)別位點(diǎn)，大多數(shù)蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生于此，羧基末端絲/蘇氨酸殘基的磷酸化程度決定著GJ 通道的通透性［9］。在心肌細(xì)胞，Cx43的磷酸化使GJ 通道關(guān)閉，去磷酸化使該通道開放。在心肌細(xì)胞，去磷酸化不僅可使GJ 通道開放，而且是通道解聚的關(guān)鍵點(diǎn)，Cx43 一旦去磷酸化，通道即開始解聚為Cx 亞單位，Cx 亞單位可進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)入胞內(nèi)儲(chǔ)存。

近年Salameh 等［10-11］探討了美托洛爾對(duì)心肌細(xì)胞Cx43 表達(dá)的影響，對(duì)新生鼠心肌細(xì)胞采用美托洛爾單獨(dú)或與異丙腎上腺素共同處理，結(jié)果顯示:美托洛爾不同異構(gòu)體均能上調(diào)GJ 通道Cx43 的表達(dá)，認(rèn)為:美托洛爾可阻止GJ 通道Cx43 的降解而發(fā)揮作用，且可能通過有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用。新近研究發(fā)現(xiàn)在Cx43 半通道的開放及胞內(nèi)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinases，ERKs)的激活抑制了骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的凋亡，這與維持細(xì)胞間生存信號(hào)(intracellular survival signaling)的交流和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有關(guān)［12-14］。

本實(shí)驗(yàn)研究中壓力負(fù)荷型HF 大鼠中給予美托洛爾治療后，雖在血流動(dòng)力學(xué)的改善方面有“天花板效應(yīng)”，而在逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、重塑病理改變方面提示美托洛爾治療有“劑量依賴效應(yīng)”，在治療劑量范圍內(nèi)劑量的增加可有效逆轉(zhuǎn)HF 時(shí)心肌肥大、壞死和纖維化，以及心肌胞外間質(zhì)、膠原纖維網(wǎng)的增生。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)HF 對(duì)照組大鼠左心室p-Cx43 表達(dá)明顯增加，予美托洛爾治療后p-Cx43 表達(dá)量隨治療劑量的增加而顯著減少，且心肌細(xì)胞凋亡水平與p-Cx43 表達(dá)水平呈正相關(guān)，隨著美托洛爾治療劑量的增加p-Cx43 表達(dá)減少，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)亦減小。結(jié)合上述背景資料和本研究結(jié)果，我們推測(cè)美托洛爾對(duì)NE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的抑制可能與維持心臟Cx43 的去磷酸化狀態(tài)而使得Cx43 降解減少和保持GJ 通道開放，從而保證細(xì)胞間生存信號(hào)的交流有關(guān)。

總之，美托洛爾對(duì)抗HF 時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌長(zhǎng)期持續(xù)激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制與Cx43 表達(dá)調(diào)控特別是磷酸化狀態(tài)的調(diào)控密切相關(guān)。對(duì)其參與細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的研究將為臨床應(yīng)用腎上腺素受體阻滯劑治療HF 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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