超濾質(zhì)譜法研究大黃蒽醌類(lèi)化合物與人血清白蛋白的相互作用

王 獻(xiàn)，喻 花

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

在藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究中，質(zhì)譜法受到了廣泛地應(yīng)用.超濾質(zhì)譜技術(shù)是一種新的分析方法，它結(jié)合了超濾裝置的分離功能和質(zhì)譜技術(shù)的分析優(yōu)勢(shì)，能夠迅速有效地檢測(cè)和鑒別出與受體蛋白質(zhì)相結(jié)合的配體小分子.故超濾質(zhì)譜技術(shù)可應(yīng)用于先導(dǎo)化合物的篩選[1,2]，組合文庫(kù)的篩選[3,4]，天然產(chǎn)物有效成分的篩選[5,11].此外，超濾質(zhì)譜技術(shù)具有分析速度快、特異性強(qiáng)、高通量的特點(diǎn)，且樣品用量少、圖譜信息量大，因此在藥物小分子和生物大分子相互作用的研究方面具有巨大的優(yōu)勢(shì).

大黃(RadixetRhizomaRhei)為蓼科植物掌葉大黃RheumPalmatumL.唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf或藥用大黃RheumofficinaleBaill的干燥根和根莖，味苦、性寒.臨床研究證明，大黃具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤、瀉下作用及抗菌、消炎、止血等多種生理活性[12].大黃的主要有效成分為蒽醌類(lèi)衍生物：大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素及它們與葡萄糖結(jié)合成的苷類(lèi)[13].

本文采用超濾質(zhì)譜法研究了人血清白蛋白(HSA)與3種蒽醌類(lèi)化合物(大黃酚、大黃酸和蘆薈大黃素)的相互作用，通過(guò)提取離子色譜峰比較了這幾種藥物與HSA的相對(duì)結(jié)合能力，在此基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化了一套超濾質(zhì)譜法，可應(yīng)用于研究和篩選與生物靶分子結(jié)合的藥物.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent 6520 Q-TOF MS，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(GL-20M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，超濾膜YM-10(美國(guó)Millipore 公司，理論截取分子量10 kDa)，超純水機(jī)(Molelement 1815a摩爾元素型，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司).

人血清白蛋白(HSA，美國(guó)Sigma)，大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素純度均≥98％(上海拉丁試劑)，甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)Merck公司)，其他試劑均為優(yōu)級(jí)純.

1.2 樣品制備

將HSA溶解于超純水中，配制成100 μM的蛋白質(zhì)母液，離心，于4℃下冷藏保存.分別準(zhǔn)確取一定質(zhì)量的大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素3種化合物，用甲醇溶解，配置成100 μM的蒽醌類(lèi)化合物混合溶液母液，離心，于4℃下冷藏保存.超濾實(shí)驗(yàn)前，用超純水5倍稀釋蛋白和藥品溶液母液得到20 μM工作液.

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

C18色譜柱(150mm×4.6mm×5 μm)，柱溫40℃，流速0.2 mL/min.液相色譜梯度洗脫條件：流動(dòng)相A為超純水，B為乙腈；t=0 min，99％ A(1％ B)；t=0～6 min，30％ A(70％ B)；t= 6～15 min，1％ A(99％ B)；t=15～25 min，1％ A(99％ B)；t=25～30 min，99％ A(1％ B)，進(jìn)樣量為5 μL.

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式檢測(cè)，離子掃描范圍50～600m/z，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速12 L/min，霧化器壓力40 psig，毛細(xì)管電壓4000V，碎裂電壓125V.

1.4 超濾實(shí)驗(yàn)

吸取20 μL三種化合物的混合工作液，20 μL (20 μM)HSA和160 μL 超純水混合均勻，室溫反應(yīng)2 h，置于YM-10超濾管中，10000 r/min離心15 min，用200 μL超純水離心清洗濾膜，重復(fù)3次，將未結(jié)合的配體小分子充分清洗干凈.再向?yàn)V膜中加入水/甲醇(50︰50,v/v)，靜置30 min，10000 r/min離心15 min，將藥物小分子從HSA上解離下來(lái)，用200 μL水/甲醇(50︰50,v/v)離心清洗濾膜，重復(fù)3次，收集洗脫液于進(jìn)樣瓶中，用LC-MS檢測(cè).實(shí)驗(yàn)以不加入蛋白質(zhì)的空白實(shí)驗(yàn)為對(duì)照組，結(jié)合組和對(duì)照組均平行實(shí)驗(yàn)3次以上.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-MS)測(cè)試條件優(yōu)化

首先建立標(biāo)準(zhǔn)品混合物L(fēng)C-ESI-MS分析測(cè)試方法.將大黃酸、蘆薈大黃素和大黃酚3種物質(zhì)配成最終濃度為2 μM的混合溶液，它們的摩爾濃度比為1︰1︰2，優(yōu)化LC-ESI-MS條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行分離測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1.

t/min

由圖1可見(jiàn)，通過(guò)優(yōu)化測(cè)試的色譜、質(zhì)譜條件，混合樣品溶液在C18柱中得到了有效分離，峰形較為對(duì)稱(chēng)，17 min內(nèi)可完成對(duì)這3種組分的分離.3種大黃蒽醌類(lèi)化合物分子式、理論同位素分子量M及形成去質(zhì)子分子離子[(M-H)-]離子質(zhì)量見(jiàn)表1.

表1 3種大黃蒽醌類(lèi)物質(zhì)分子式、精確分子量和形成負(fù)離子的質(zhì)量

EIC圖中3組峰分別所對(duì)應(yīng)的ESI-MS質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2.對(duì)比表1可知，圖2(a)中m/z為283.0287,269.0491,253.0534的分別是大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚的[(M-H)-]峰，故根據(jù)質(zhì)譜圖可以確定圖1中3種物質(zhì)1、2、3分別為大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚.

m/z

2.2 大黃蒽醌類(lèi)化合物和人血清白蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)

超濾實(shí)驗(yàn)完成后，收集解離下來(lái)的大黃蒽醌類(lèi)化合物混合溶液進(jìn)LC-MS檢測(cè)，檢測(cè)條件參照標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試條件.對(duì)所得的總離子流圖(TIC)進(jìn)行3種大黃蒽醌類(lèi)化合物的精確分子量的提取離子分析，結(jié)果見(jiàn)圖3.如圖3所示，結(jié)合組的3個(gè)提取離子流圖 (EIC)色譜峰(即加入蛋白組，實(shí)線(xiàn)所示)均在不同程度上高于對(duì)照組(即未加蛋白質(zhì)組，虛線(xiàn)所示)對(duì)應(yīng)的EIC色譜峰.相同的色譜、質(zhì)譜條件下，EIC色譜峰的積分面積與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比，通過(guò)實(shí)驗(yàn)組和空白組的EIC色譜峰鋒面積差異可知3種大黃蒽醌類(lèi)化合物和HSA均有不同程度的結(jié)合，其中大黃酸的結(jié)合能力較強(qiáng)，其次是蘆薈大黃素，大黃酚的結(jié)合能力最弱.

圖3中3組峰分別對(duì)應(yīng)的ESI-MS質(zhì)譜圖(圖略)與標(biāo)準(zhǔn)溶液圖2一致，分別對(duì)應(yīng)保留時(shí)間為8.942,12.636,16.565 min的質(zhì)譜圖.由Q-TOF MS給出的精確分子量信息可知，m/z為283.0287的是大黃酸的[(M-H)-]峰，m/z為269.0491的是蘆薈大黃素的[(M-H)-]峰，m/z為253.0534的是大黃酚的[(M-H)-]峰.根據(jù)質(zhì)譜圖可以確定圖3中3種物質(zhì)按照洗脫時(shí)間順序依次為大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚，與上述標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間一致.

t/min

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)構(gòu)建超濾質(zhì)譜法研究大黃蒽醌類(lèi)化合物和人血清白蛋白的相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚3種藥物均可與HSA結(jié)合，相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度為大黃酸﹥蘆薈大黃素﹥大黃酚，驗(yàn)證了超濾質(zhì)譜法是一種研究配體和蛋白質(zhì)的相互作用快速靈敏有效的分析方法.超濾實(shí)驗(yàn)中同時(shí)考慮配體和蛋白質(zhì)的濃度、孵育時(shí)間、解離溶劑的選擇、超濾膜的選擇等，獲得了準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).該超濾質(zhì)譜方法可廣泛應(yīng)用于對(duì)與各類(lèi)生物靶分子相互作用的天然產(chǎn)物和藥物的篩選工作.

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