超濾耦合徑向流色譜分離純化靈芝多糖的研究

邵 平, 劉 青, 陳純彬, 秦敏樸, 孫培龍

1.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院， 杭州 310014；2.浙江一派食品有限公司， 浙江 金華 321100

靈芝是一類屬于擔(dān)子菌亞門的白腐真菌，在我國作為醫(yī)藥原材料已有上百年歷史，目前已廣泛用于保健品和中草藥的開發(fā)[1,2]。研究表明，靈芝中含有三萜類、多糖甾醇類、氨基酸多肽類、呋喃類衍生物等活性物質(zhì)，對(duì)糖尿病、心血管病、腫瘤等疾病的預(yù)防和治療具有一定的功效[3～5]。而多糖作為靈芝中的主要活性成分，傳統(tǒng)提取方法得率較低；若采用酶解法水解多糖，可有效破壞細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)多糖，從而增強(qiáng)多糖的提取率[6,7]。

研究表明[8,9]，酶解后的多糖中，仍含有蛋白質(zhì)、果膠等大分子，為了提高多糖純度，需要進(jìn)一步分離純化。通過超濾，則能對(duì)這些雜質(zhì)有效地去除，并能實(shí)現(xiàn)不同分子量多糖的分級(jí)[10]，便于今后對(duì)多糖活性的研究。超濾是一種以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，基于機(jī)械篩分原理，以膜兩側(cè)壓差為動(dòng)力，對(duì)雙組分或多組分的液-液混合體系進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和富集的溶液分離過程[11]。目前，超濾已用于多糖、中藥、酶制劑等有效成分的提取分離應(yīng)用中[12～14]。Li等[15]用切向流超濾海藻胞外聚合物取得了比較好的效果，并驗(yàn)證了中試規(guī)?；a(chǎn)的可行性；肖如武等[16]采用超濾對(duì)藍(lán)蛤蛋白酶解液中不同分子量的呈味肽實(shí)現(xiàn)了富集濃縮，其中，小于3 kU肽段的含量由47.26%提高到76.66%；張寧[17]通過截留分子量為50 kDa中空纖維超濾膜濃縮土壤桿菌胞外多糖的發(fā)酵液，去除了發(fā)酵液中的蔗糖、氮源及無機(jī)離子，多糖回收率達(dá)82.7%。因此，作為分離純化多糖的一種重要手段，超濾越來越受到人們的重視。

本文采用超濾對(duì)靈芝多糖酶解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，確定了適宜的膜超濾參數(shù)。比較了超濾耦合徑向流色譜法與其他方法脫蛋白的效率，為該法在多糖工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實(shí)體；苯酚、濃硫酸、氫氧化鈣、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅，葡萄糖等試劑均為分析純；纖維素酶，8萬U/g，張家港金源生物化工有限公司產(chǎn)品；木瓜蛋白酶，100萬U/g，購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

紫外-可見分光光度計(jì)，752型，上海光學(xué)儀器有限公司；低速冷凍離心機(jī)，L535R型，長沙湘儀離心機(jī)有限公司；恒速攪拌器，S-212型，上海申勝生物技術(shù)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2型，榮華儀器制造有限公司；電子天平，PL602型，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計(jì)，PHSJ-4A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平，AR1140型，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；超濾系統(tǒng)，Congent M，美國密理博公司；超濾膜為改良聚醚砜復(fù)合膜(PES)，膜面積0.1 m2，膜分子量分別為100 kDa、30 kDa和10 kDa，其中100 kDa膜為tpye C，30 kDa和10 kDa膜為type A。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1靈芝多糖的酶解 使用復(fù)合酶(木瓜蛋白酶∶纖維素酶=2∶1)在56℃、pH 7.0條件下水解靈芝子實(shí)體多糖，多糖酶解液經(jīng)8 000 r/min離心10 min后，上清液儲(chǔ)存于4℃下備用[18]。

1.3.2超濾膜的選擇 在室溫及壓力小于30 psi條件下，將酶解液依次通過截留分子量為100 kDa、30 kDa和10 kDa的超濾膜，然后測(cè)定每段分子量間的多糖含量，分析靈芝多糖的分子量分布。以多糖的截留率、蛋白質(zhì)去除率及膜的性能為指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同孔徑超濾膜的過濾效果。

1.3.3超濾耦合徑向流色譜分離靈芝多糖工藝流程 在不同步驟分別采用徑向流色譜法、軸向色譜法和Sevag法脫除靈芝子實(shí)體中的多糖蛋白。

徑向流色譜法：上樣量為100 mL，上樣濃度為10 mL/min，上樣流速為2 mL/min，洗脫流速為50 mL/min；色譜柱參數(shù)：柱體積250 mL，床層高度為3 cm，柱高5 cm。

軸向色譜法：上樣量為100 mL，上樣濃度為10 mL/min，上樣流速為2 mL/min，洗脫流速為50 mL/min；色譜柱參數(shù)為：柱體積250 mL，床層高度為46 cm，柱高50 cm。

Sevag法：取截留液與Sevag試劑(3∶1)混合，分液漏斗中充分振蕩30 min，靜置3 h，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.4 測(cè)定和計(jì)算方法

總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[19]。多糖濃度和吸光度的線性回歸方程為：

y=0.007 6x+0.019，R2=0.999 3

其中，y為吸光值，x為葡萄糖含量(μg)。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Folin-酚法[20]。牛血清白蛋白濃度與吸光值的線性回歸方程為：

y=0.003 4x+0.095 9，R2=0.998 6

其中，y為吸光值，x為牛血清蛋白含量(μg)。

多糖截留率[21]的計(jì)算公式為：

其中，V2，ρ2分別為超濾后浸提液的體積和多糖的質(zhì)量濃度；V1，ρ1分別為超濾前浸提液的體積和多糖的質(zhì)量濃度。

蛋白質(zhì)脫除率的計(jì)算公式為：

超濾通量[21～23]用單位時(shí)間內(nèi)通過單位面積的透過液量表示：

J=V/tA

其中：J為超濾通量[mL/(cm2·min)]；V為透過液體積(mL)；A為膜的有效面積(m2)；t為超濾時(shí)間(min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布

將靈芝多糖酶解液依次通過不同孔徑的超濾膜，超濾膜對(duì)多糖分子的截流效果見圖1A，其相對(duì)分子質(zhì)量分布如圖1B。

圖1 靈芝子實(shí)體酶解液中多糖的膜截流率(A)和相對(duì)分子質(zhì)量分布(B)Fig.1 Flow rate (A) and relative molecular mass distribution (B) of polysaccharide in hydrolyzate of Ganoderma lucidum fruiting bodies.

由圖1可以看出，酶解液多糖以相對(duì)分子質(zhì)量100 kDa以上為主，含量達(dá)63.32%；其次為分子量小于10 kDa的多糖，含量為19.96%；相對(duì)分子量30～100 kDa及10～30 kDa之間的多糖含量相當(dāng)，分別為8.4%和8.32%。此外，不同分子量的超濾膜對(duì)靈芝子實(shí)體酶解液多糖的截留率差異顯著，隨著膜孔徑的增大，多糖截留率降低。其中，10 kDa的超濾膜對(duì)多糖的截留率約為80.12%，而30 kDa和100 kDa的超濾膜對(duì)多糖的截留率分別為71.83%和63.32%。

2.2 不同分子量超濾膜的蛋白去除率

超濾膜在截留多糖的同時(shí)，也使得部分大分子蛋白質(zhì)難以脫除。不同分子量的超濾膜對(duì)蛋白質(zhì)的脫除效果如圖2所示。

圖2 不同分子量膜對(duì)靈芝子實(shí)體多糖酶解液的蛋白質(zhì)去除率Fig.2 The protein removal rate of different ultrafiltration membranes from hydrolyzate of Ganoderma lucidum fruiting bodies.

分別對(duì)分子量100 kDa、30 kDa、10 kDa超濾膜超濾所得截留液以及濾過液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，結(jié)果顯示，10 kDa和30 kDa超濾膜對(duì)蛋白質(zhì)的脫除率分別為70.81%和77.62%，100 kDa超濾膜對(duì)蛋白質(zhì)的脫除率最高，達(dá)82.21%。隨著超濾膜分子量的增大，蛋白質(zhì)去除率提高。這是由于實(shí)驗(yàn)中用于超濾的靈芝子實(shí)體多糖溶液是經(jīng)過纖維素酶和蛋白酶復(fù)合酶解靈芝子實(shí)體所得，因此較其他提取方法所得粗多糖溶液，酶解液中含有相對(duì)較多的游離小分子蛋白質(zhì)。

2.3 不同分子量超濾膜膜參數(shù)的測(cè)定

在料液濃度、超濾時(shí)間、料液體積流量等參數(shù)相同的條件下，分別研究純水體積流量對(duì)超濾膜通量的影響及酶解液體積流速百分比對(duì)超濾系統(tǒng)壓力的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3A中可以看出，隨著純水體積流速的增加，超濾膜通量均不斷增大，其中尤以100 kDa超濾膜的增速最快。此外，在相同的純水體積流速下，100 kDa超濾膜具有最大的超濾通量。在圖3B中，隨著酶解液體積流速的增加，10 kDa超濾膜的壓力增加最為顯著，30 kDa超濾膜次之，而100 kDa超濾膜最小。30 kDa超濾膜與100 kDa超濾膜在小流速下較為接近，而隨著流速的增加，100 kDa超濾膜的壓力增幅較30 kDa超濾膜小。由于膜材料的不同(10 kDa和30 kDa超濾膜的材料為tpye A，而100 kDa超濾膜的材料為tpye C)，因此三種膜在膜參數(shù)性質(zhì)上并不成比例關(guān)系。

圖3 不同分子量超濾膜的膜參數(shù)Fig.3 Parameters of ultrafiltration by membranes with different cut-off molecular mass.

2.4 料液體積流量對(duì)超濾通量及超濾壓力的影響

在料液濃度、超濾時(shí)間、濃縮倍數(shù)等相同的條件下，研究了料液體積流量對(duì)膜通量及壓力的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液體積流速對(duì)超濾性能的影響Fig.4 Effect of flow rate on the ultrafiltration performance.

料液體積流量對(duì)超濾通量的影響，主要是由體積流量的增大，料液流動(dòng)狀態(tài)發(fā)生變化所致。隨著料液體積流量的增加，增大了流體主體湍流程度，減弱了膜面凝膠層和流動(dòng)邊界層厚度，使?jié)獠顦O化現(xiàn)象減弱，超濾通量增加并趨于穩(wěn)定[21]。料液體積流量對(duì)超濾壓力的影響，主要是隨著體積流量的增大，料液即時(shí)濃度的增大。當(dāng)單位時(shí)間內(nèi)流體中大分子物質(zhì)含量越高，則超濾壓力越大。如圖4所示，當(dāng)體積流量不斷增加，雖然超濾通量不斷增長，但隨之超濾壓力也不斷上升。實(shí)驗(yàn)中，由于超濾膜的壓力承受能力不高于30 psi，因此根據(jù)圖4，選擇20%泵速(500 mL/min)的料液體積流量，即100 mL/min。

2.5 超濾時(shí)間對(duì)超濾通量及超濾壓力的影響

在料液濃度、料液體積流量、濃縮倍數(shù)等相同的條件下，研究了超濾時(shí)間對(duì)膜通量及壓力的影響，結(jié)果如圖5所示。

對(duì)于高分子溶液，在一定的超濾壓力下，隨著凝膠層厚度的增加，超濾通量會(huì)不斷減少。如圖5所示，本實(shí)驗(yàn)的超濾通量-超濾時(shí)間的關(guān)系基本符合這一規(guī)律。在超濾運(yùn)行的初期，因?yàn)槟け砻鏌o其他物質(zhì)，阻力較小，因此超濾通量維持較穩(wěn)定狀態(tài)；隨著超濾的不斷進(jìn)行，在膜表面迅速吸附有機(jī)膠體等物質(zhì)，超濾通量下降較快[21,22]。綜合考慮超濾通量及壓力，試驗(yàn)選擇兩條曲線交點(diǎn)的時(shí)間，即超濾時(shí)間60 min。

圖5 超濾時(shí)間對(duì)超濾性能的影響Fig.5 Effect of time on ultrafiltration performance.

2.6 濃縮倍數(shù)對(duì)超濾分離性能的影響

在料液濃度、料液體積流量、超濾時(shí)間等相同的條件下，研究了濃縮倍數(shù)對(duì)膜通量及壓力的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 濃縮倍數(shù)對(duì)超濾性能的影響Fig.6 Effect of concentration multiple on ultrafiltration performance.

超濾通量曲線顯示，在濃縮倍數(shù)為2～8倍時(shí)，通量下降較為顯著，10倍以后逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。一方面隨著濃縮倍數(shù)的增加，膜表面的凝膠層形成加快及傳質(zhì)層增厚，產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象，使得膜面污染加重[21～23]；此外，料液中溶質(zhì)含量的增加引起滲透壓增加，這兩者均導(dǎo)致超濾通量迅速下降。截留率曲線顯示了濃縮倍數(shù)對(duì)其影響，可以看到在濃縮倍數(shù)為2～6倍期間，多糖截留率迅速下降，而當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到8～10倍后多糖截留率已趨于穩(wěn)定。從生產(chǎn)效率和工藝要求上來考慮，適當(dāng)?shù)臐饪s倍數(shù)，可以減少膜形成不可逆的凝膠層，便于清洗和下一階段的醇沉工藝[21]。因此，綜上所述，濃縮倍數(shù)為15～17倍時(shí)較為合適。

考察了三個(gè)參數(shù)對(duì)超濾通量、超濾壓力及超濾分離性能的影響，得到了100 kDa超濾膜適宜的工藝參數(shù)為：室溫，壓力小于30 psi，料液體積流量100 mL/min，超濾時(shí)間60 min，濃縮倍數(shù)為15～17倍，此條件下多糖截留率為63.32%，蛋白質(zhì)去除率為82.21%。

2.7 不同方法脫除靈芝子實(shí)體多糖蛋白質(zhì)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)研究比較了超濾耦合徑向流色譜法與單一色譜法方法及Sevag法脫除蛋白質(zhì)的效果，分別從蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率兩方面綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1所示。

表1 不同方法脫除靈芝子實(shí)體多糖蛋白質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果比較Table 1 Comparison of different protein removal methods.

從表1中可以看出，超濾耦合徑向流色譜脫除靈芝粗多糖中的蛋白質(zhì)有顯著效果，基本實(shí)現(xiàn)了完全脫除。單獨(dú)使用徑向流色譜脫除酶解液中的蛋白質(zhì)，脫除率僅為80.59%；而同傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，蛋白脫除率與多糖回收率分別高出56.84%和30.84%；與軸向色譜比較，蛋白質(zhì)脫除率提高了25%，而多糖回收率基本一致。

3 討論

具有生理活性的多糖分子量一般較高(>10 kDa)[24,25]，靈芝子實(shí)體酶解液中分子量10 kDa以下的多糖含量為19.96%，10～100 kDa之間的多糖含量僅有16.72%，酶解液多糖以分子量10010 kDa以上為主。本研究中，100 kDa超濾膜的多糖截留率約為63.32%，蛋白去除率可達(dá)82.21%，且在超濾通量及超濾壓力等膜參數(shù)上均優(yōu)于10 kDa和30 kDa超濾膜。因此，在綜合考慮實(shí)驗(yàn)工作效率等的基礎(chǔ)上，選擇100 kDa超濾膜進(jìn)行研究，而對(duì)分子量小于100 kDa的多糖暫不研究。

采用截留分子量為100 kDa的超濾膜對(duì)靈芝多糖酶解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，合適的工藝條件為:室溫,壓力小于30 psi，料液體積流量100 mL/min，超濾時(shí)間60 min，濃縮倍數(shù)為15～17倍，截留液通過超濾和徑向流色譜純化，無需經(jīng)過醇沉工藝，即可達(dá)到高蛋白脫除率及多糖截留率。采用該耦合法，蛋白質(zhì)脫除率及多糖截留率分別高達(dá)99.24%和89.52%，相比單一色譜法及Sevag法，明顯改善了多糖中的蛋白質(zhì)脫除效果及得率的提高。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Russell R, Paterson M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J]. Phytochemistry,2006, 67(18):1985-2001.

[2] Chan W K, Cheung C C H, Law H K W,etal..Ganodermalucidumpolysaccharides can induce human monocytic leukemia cells into dendritic cells with immuno-stimulatory function [J].J. Hematol. Oncol., 2008,1:9.

[3] Seto S W, Lam T Y, Tam H L,etal.. Novel hypoglycemic effects ofGanodermalucidumwater-extract in obese/diabetc (db/db) mice[J]. Phytomedicine, 2009, 16: 426-436.

[4] Hsu S C, Ou C C, Chuang T C,etal..Ganodermatsugaeextract inhibits expression of epidermal growth factor receptor and angiogenesis in human epidermoid carcinoma cells:invitroandinvivo[J]. Cancer Lett., 2009, 281(1): 108-116.

[5] Yuen J W, Gohel M D. Anticancer effects ofGanodermalucidum: a review of scientific evidence[J]. Nutr. Cancer, 2005, 53(1): 11-17.

[6] 程俊文,吳學(xué)謙,賀 亮,等.香菇子實(shí)體多糖分步酶解法提取研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2009, 16(2): 67-71.

[7] 王元鳳,金征宇.酶法提取茶多糖工藝的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(3): 122-124.

[8] 劉紅梅,李 棟,樊夢(mèng)丹,等.灰樹花多糖的復(fù)合酶-微波提取、超濾純化及生物學(xué)評(píng)價(jià)[J].中草藥, 2011,33(4):594-599.

[9] 李 倩,田春芳,劉雯霞,等.超聲波復(fù)合酶法提取軟紫草多糖的工藝優(yōu)化[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2012, 29(6):498-503.

[10] 謝紅旗.周春山.杜邵龍,等.酶法提取、超濾分離香菇多糖新工藝研究[J].食品科學(xué),2007,28(4)：217-219.

[11] 李錦生,傅曉琴,李 冰,等.功能性生物活性物質(zhì)超濾分離純化技術(shù)的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報(bào), 2010,10(2): 174-179.

[12] Sun H J, Qi D, Xu J Y,etal.. Fractionation of polysaccharides from rapeseed by ultrafiltration: effect of molecular pore size and operation conditions on the membrane performance[J]. Sep. Purifi.Technol.,2011,80: 670-676.

[13] 陳 余. 膜分離技術(shù)在中藥提取分離中的應(yīng)用[J].化學(xué)工程與裝備,2013,(2):126-128.

[14] Toussain G, Ding L H, Jaffrin M Y,etal.. Recover of alpha agarase enzyme from fermentation broths by membrane crossflow filtration [J].Sep. Sci. Technol.,2000,35(5): 795-809.

[15] Li H F, Li Z W, Xiong S Q,etal.. Pilot-scale isolation of bioactive extracellular polymeric substances from cell-freemedia of mass microalgal cultures using tangential-flow ultrafiltration [J]. Process Biochem.,2011,46: 1104-1109.

[16] 肖如武, 趙謀明.藍(lán)蛤蛋白酶解液超濾分離特性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(5): 23-27.

[17] 張 寧,彭志英.中空纖維超濾膜濃縮胞外多糖PS-9415發(fā)酵液的研究[J].食品工業(yè)與科技,2003,24(2): 24-27.

[18] 林炳誼.徑向流色譜過程動(dòng)力學(xué)模型的建立及其在靈芝多糖分離純化中的應(yīng)用研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學(xué),碩士學(xué)位論文，2011.

[19] Monobe M, Ema K, Kato F,etal.. Immunostimulating activity of a crude polysaccharide derived from green tea (Camelliasinensis) extract[J].Agric. Food Chem.,2008,56(4): 1423-1427.

[20] Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L,etal.. Protein measurement with the Folin-Phenol reagents [J]. J. Biol. Chem.,1951, 193: 265-275.

[21] 楊 寧,趙謀明,崔春等. 仙人掌多糖的超濾膜分離提取及其影響因素[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,35(4): 42-45.

[22] 李 琳,朱 杰,傅曉琴,等.中試超濾系統(tǒng)濃縮分離南瓜多糖[J].食品科學(xué),2009,30(22): 33-36.

[23] 孫 瑜,周永傳,陳德煦.超濾法純化大黃多糖的研究[J].中國中藥雜志,2009,34(2): 165-168.

[24] Suarez E R, Syvitski R, Kralovec J A,etal.. Immunostimulatory polysaccharides fromChlorellapyrenoidosa. A new galactofuranan. measurement of molecular weight and molecular weight dispersion by DOSY NMR[J]. Biomacromolecules, 2006,7(8):2368-2376.

[25] Qiu T, Ma X J, Ye M,etal.. Purification, structure, lipid lowering and liver protecting effects of polysaccharide fromLachnumYM281[J]. Carbohydr. Polym., 2013,98: 922-930.