子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜組織中TLR4及MyD88的表達(dá)

李 潔，申愛(ài)榮，楊春麗，吳 允

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450052

#通訊作者，女，1954年8月生，本科，教授，主任醫(yī)師，研究方向:子宮內(nèi)膜異位癥，E-mail:shenairong08@163.com

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是具有生 長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織碎片出現(xiàn)在子宮腔及子宮肌層以外的其他部位，以痛經(jīng)和不孕為主要臨床癥狀［1］。EMs 的發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。近幾年免疫功能的改變與EMs 發(fā)病之間的關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注。Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一種近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的固有免疫受體，參與固有免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其免疫調(diào)節(jié)失衡與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4 信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其依賴(lài)的信號(hào)通路以及調(diào)控的基因產(chǎn)物在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用［2］。關(guān)于TLR4-MyD88 通路與EMs 的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。作者檢測(cè)了EMs 患者異位及在位內(nèi)膜組織中TLR4 和MyD88 的表達(dá)，以探討其在臨床可能存在的指導(dǎo)意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年6月至2012年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院并經(jīng)病理證實(shí)為EMs 的患者45例，年齡20～46(30.5±6.9)歲，采用美國(guó)生育學(xué)會(huì)1985年修訂的分期標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS)進(jìn)行分期，其中Ⅰ、Ⅱ期15例，Ⅲ、Ⅳ期30例。分別取其異位內(nèi)膜組織45例為異位內(nèi)膜組，在位內(nèi)膜組織30例為在位內(nèi)膜組;另選取同期因子宮縱隔行宮腔鏡手術(shù)患者的正常內(nèi)膜組織30例為對(duì)照組，患者年齡21～37(29.0±7.4)歲。所有患者對(duì)該研究均知情同意，月經(jīng)周期規(guī)律，術(shù)前6 個(gè)月未接受激素治療，排除有子宮腺肌癥及腫瘤病史者，均無(wú)嚴(yán)重內(nèi)科合并癥。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol、RT 試劑盒、PCR 試劑盒及Marker 均購(gòu)自Transgene 公司，兔抗人MyD88、TLR4 多克隆抗體由北京博奧森生物公司提供，SP 試劑盒、DAB 均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自Eppendorf 公司，D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)購(gòu)自大連Jim-X Scientific 公司。引物由北京博大泰克生物基因技術(shù)公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3 3組中TLR4 和MyD88 mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定 采用半定量RT-PCR 法。Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，取2 μL 后續(xù)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，TLR4、MyD88、β-actin分別于50、55、55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán);最后72℃總延伸6 min。行EB 染色瓊脂糖凝膠電泳，用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，目的基因的表達(dá)量以其DNA 條帶和β-actin的DNA 條帶灰度值的比值表示。

1.4 3組中TLR4 和MyD88 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定采用免疫組化SP 法。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，一抗均按1:50 稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜后滴加二抗，37℃孵育30 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗復(fù)合物，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。采用ITP 圖像分析軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行平均積分光密度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組間TLR4 與MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t法;采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)比較EMsⅠ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期患者異位內(nèi)膜組織中TLR4 與MyD88 mRNA 和蛋白表達(dá)水平的差異;采用Pearson 相關(guān)分析在位內(nèi)膜組及異位內(nèi)膜組中TLR4 和MyD88 蛋白與mRNA 表達(dá)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組中TLR4 與MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平 TLR4 和MyD88 蛋白主要在腺體上皮細(xì)胞表達(dá)，TLR4 蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜，MyD88 蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)。間質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)。3組TLR4 與MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)比較，見(jiàn)圖1、圖2和表2;TLR4 和MyD88 的mRNA 及蛋白在EMs患者不同分期異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較，見(jiàn)表3。

圖1 各組內(nèi)膜組織中TLR4(上)及MyD88(下)mRNA 的表達(dá)情況

圖2 各組內(nèi)膜組織中TLR4(A)和MyD88(B)蛋白的表達(dá)情況(SP，×400)

表2 3 種組織中TLR4 和MyD88 的mRNA 及蛋白表達(dá)情況

表3 TLR4 和MyD88 mRNA 及蛋白在不同分期EMs 患者異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況

2.2 在位內(nèi)膜組及異位內(nèi)膜組TLR4 和MyD88 mRNA 及蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在位內(nèi)膜組TLR4 及MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r =0.594、0.560，P 均＜0.001);異位內(nèi)膜組TLR4 及MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平亦均呈正相關(guān)(r=0.812、0.639，P 均＜0.001)。

3 討論

3.1 TLR4 與EMs TLRs 是一類(lèi)病原分子識(shí)別受體，可以引發(fā)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)機(jī)體獲得免疫反應(yīng)［3-4］。TLR4 是TLRs 中關(guān)鍵的一個(gè)分子。趙先蘭等［5］研究表明:TLR4 通路可能在子癇前期的發(fā)生中起著重要作用。該研究結(jié)果顯示，TLR4 mRNA 及蛋白在EMs 患者的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)均高于對(duì)照組織。推測(cè)當(dāng)宮腔感染時(shí)，對(duì)照組低表達(dá)的TLR4 不能引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，對(duì)內(nèi)膜起保護(hù)作用。而EMs 患者的在位內(nèi)膜組織中TLR4高表達(dá)，更易被激活，引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。這也佐證了“在位內(nèi)膜決定論”［6］。這種作用機(jī)制有可能與腸黏膜發(fā)生感染的機(jī)制相似［7］。此外，EMs 患者異位內(nèi)膜組織高表達(dá)TLR4，因此推測(cè)TLR4 與EMs的發(fā)病有密切關(guān)系。研究［8-9］證實(shí)，正常的腸上皮低表達(dá)TLR4，使腸上皮對(duì)共生菌保持免疫耐受。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Allhorn 等［10］的研究結(jié)果不相符，其結(jié)果表明:EMs 患者的在位內(nèi)膜組織中TLR3、TLR4 蛋白表達(dá)均低于正常內(nèi)膜組織，而在相對(duì)應(yīng)的宮骶韌帶處異位內(nèi)膜腺上皮表達(dá)明顯增高。作者推測(cè)這可能與統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差或種族差異有關(guān)。

3.2 MyD88 與EMs 有研究［11］表明，TLR4/MyD88 信號(hào)通路在LPS 誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用，敲除基因TLR4 或用siRNA 沉默其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MyD88，可減少上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS 的炎癥應(yīng)答。該研究結(jié)果顯示，異位內(nèi)膜組MyD88 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平均高于在位內(nèi)膜組及對(duì)照組，且在位內(nèi)膜組的表達(dá)水平亦高于對(duì)照組。推測(cè)MyD88 在TLR4/MyD88 通路中被激活，在EMs 的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中有著重要意義。

3.3 TLR4 與MyD88 的相關(guān)性及其在EMs 發(fā)病機(jī)制中的作用 作者發(fā)現(xiàn)，TLR4 和MyD88 在EMs患者異位內(nèi)膜組織及在位內(nèi)膜組織均呈高表達(dá)，且在在位內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織中TLR4 與MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均呈正相關(guān)。推測(cè)TLR4/MyD88 通路在在位內(nèi)膜被激活，進(jìn)而產(chǎn)生瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活絲裂原激活的蛋白激酶及轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB 通路，從而使細(xì)胞因子、炎癥因子、炎癥趨化因子、Ⅰ型IFNs 等分泌增加，異常的子宮內(nèi)膜逆流于腹腔中，其分泌的化學(xué)物質(zhì)有助于黏附、侵襲、血管生成，形成EMs 異位病灶［12-13］。此外，該研究結(jié)果還顯示，異位組織Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期的TLR4 和MyD88 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)TLR4 和MyD88 只參與了EMs 的早期發(fā)病但不影響疾病的進(jìn)展。

綜上所述，TLR4/MyD88 在在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中高表達(dá)，TLR4/MyD88 信號(hào)通路可能在EMs 的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用;提示可能可以通過(guò)干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的某個(gè)環(huán)節(jié)在早期階段阻止病情進(jìn)展，為EMs 的治療提供新的方案。關(guān)于TLR4/MyD88 信號(hào)通路如何參與EMs 的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步研究證明。

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