Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張艷艷 張曉艷 付旭東 周少龍 王新軍△

1）鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001 2）鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）為兒童最常見的顱外腫瘤。傳統(tǒng)的治療手段在一定程度上提高了部分低危NB患兒的生存率，但高危NB患兒的預(yù)后仍然不理想。原癌基因Bcl-2最早發(fā)現(xiàn)于濾泡性淋巴瘤染色體斷端t（14；18），可調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡或凋亡。研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的NB中有1／3表達(dá)Bcl-2，而且Bc1-2的高表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為和預(yù)后不良有密切關(guān)系［1］。本研究通過設(shè)計(jì)Bc1-2反義核酸（antisense oligonucleotides，ASODN），應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine（Gibco）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人NB細(xì)胞株SK-N-SH，考察Bcl-2反義核酸對(duì)人NB細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡的影響。以期今后對(duì)NB患兒的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人NB細(xì)胞株SK-N-SH購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。用含有10%優(yōu)級(jí)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。Bcl-2反義核酸ASODN的序列鏈為5＇-tctcccagcgtgcgccat-3＇，正義鏈SODN序列為5＇-taccgcgtgcgaccctct-3＇，為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；MTT購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)共分3組Bcl-2反義核酸組（ASODN＋Gibco）、正義核酸組（SODN＋Gibco）、脂質(zhì)體組（只加Gibco）及空白對(duì)照組。ASODN和SODN組：分別加入10 μmol／L ASODN或SODN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。脂質(zhì)體組：細(xì)胞中加入與ASODN和SODN組等體積脂質(zhì)體培養(yǎng)。

1.2.2 SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)：將SK-N-SH細(xì)胞用含有10%胎牛血清，100U／mL青霉素和100U／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照LipofectamineTM 2 000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于24孔板，24h細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液待轉(zhuǎn)染。ASODN與LipofectamineTM 2 000分別用適量不含血清和抗生素的DMEM稀釋，5min內(nèi)將其混合，室溫靜置20min后加入細(xì)胞孔中，置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。選用反義核酸與脂質(zhì)體最佳轉(zhuǎn)染比例為1.0OD∶50μL。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將各組細(xì)胞分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h從培養(yǎng)箱中取出，加入1g／L MTT 20μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心后棄上清液，每孔加DMSO 100μL，震蕩10min，使結(jié)晶完全溶解。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率。抑制率＝（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值／對(duì)照組平均A值）×100%。

1.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期 加藥培養(yǎng)72h后，6孔板中所有細(xì)胞，用PBS洗滌2次，70%的冰乙醇1mL固定細(xì)胞置4℃過夜。冰PBS洗滌3次，再加入PI 50μL，標(biāo)記30min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡 加藥培養(yǎng)72h后，收集6孔板中所有細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒操作，用AnnexinV-FITC／PI雙染法上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。以早期凋亡細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。檢驗(yàn)的顯著性水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞從轉(zhuǎn)染后24～72h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，見表1。ASODN組較空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余3組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ASODN對(duì)SK-N-SH細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

表1 Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞抑制率 （%，±s）

表1 Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞抑制率 （%，±s）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.001

組別 n 24h 48h 72h對(duì)照組6 0 0 0 Gibco組 6 1.68±1.03 2.45±0.96 3.21±1.21 SODN＋Gibco組 6 2.07±1.27 2.84±1.75 3.35±1.02 ASODN＋Gibco組 6 32.13±2.34＊44.09 ±3.26＊68.24 ±2.41 ＊

2.2 Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞周期和凋亡的影響 FCM檢測(cè)結(jié)果見表2。經(jīng)Bcl-2反義核酸處理72h后，ASODN組G2／M期的細(xì)胞比率（24.8±0.4）%和細(xì)胞早期凋亡率（23.25%）較空白對(duì)照組明顯增加（均P＜0.01）；其余各組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異（均P＞0.05）。

表2 Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞周期和凋亡的影響 （±s）

表2 Bcl-2反義核酸對(duì)SK-N-SH細(xì)胞周期和凋亡的影響 （±s）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.01

組別 G0／G1 S G2／M 凋亡率（%）對(duì)照組41.9±1.3 45.6±1.9 13.8±1.3 0.32±0.12 Gibco組 42.0±3.4 41.4±2.6 16.3±2.3 3.53±0.35 SODN＋Gibco組 45.3±2.7 37.4±1.5 18.1±4.2 4.86±1.26 ASODN＋Gibco組 37.1±2.3＊38.3 ±2.6 24.8±0.4＊23.25 ±2.34 ＊

3 討論

BcL-2（B-cell lymphoma／Leukemia-2）原癌基因是抑制細(xì)胞凋亡的重要基因。針對(duì)BcL-2的反義核酸技術(shù)能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或增加腫瘤對(duì)傳統(tǒng)藥物的敏感性［2］。本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)BcL-2的反義核酸ASODN，另又設(shè)計(jì)了正義核酸SODN作為與ASODN相對(duì)照的特異序列。細(xì)胞增殖與凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示正義序列對(duì)細(xì)胞的增殖與凋亡沒有明顯影響。

研究發(fā)現(xiàn)［3］細(xì)胞增殖周期調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞周期破壞常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染BcL-2反義核酸后72h，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到68.24%，明顯高于正義組和脂質(zhì)體組（P＜0.01）。與一些反義核酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖研究結(jié)果一致［4］。

本研究用FCM檢測(cè)BcL-2反義核酸作用后細(xì)胞周期分布特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G2／M期細(xì)胞數(shù)量明顯升高。表明細(xì)胞周期阻滯于G2／M期，這可能是BcL-2反義核酸抑制SK-NSH細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。抑制凋亡基因Bcl-2是促進(jìn)凋亡發(fā)生的線粒體依賴途徑的重要調(diào)控者［5］。本研究FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：Bcl-2反義核酸轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞凋亡率大幅增加，達(dá)到23.25%。這與Lombet等［5］的研究結(jié)果是一致的。

以上研究證實(shí)：脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染BcL-2反義核酸進(jìn)入人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期于G2／M期，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此BcL-2基因有望成為NB患兒腫瘤靶向治療的靶基因。

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