植物乳桿菌大米發(fā)酵條件的優(yōu)化

周顯青，陶華堂，王學(xué)鋒

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

中國傳統(tǒng)食品工業(yè)和現(xiàn)代化是振興民族食品工業(yè)、發(fā)展中國特色的現(xiàn)代食品工業(yè)的必要途徑.傳統(tǒng)食品工業(yè)化的研究已引起了廣泛重視[1].米粉(Rice Noodles)是以大米為原料制成的條狀或片狀產(chǎn)品，屬大宗農(nóng)產(chǎn)品深加工的主要產(chǎn)品之一，在我國及東南亞具有廣闊市場[2].發(fā)酵可使大米粉的化學(xué)成分發(fā)生顯著變化，進(jìn)而對大米粉的理化特性和最終產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響，其食味品質(zhì)有較大改善，表現(xiàn)為更加柔韌筋道.發(fā)酵過程中，微生物的產(chǎn)酸和酶對米粉品質(zhì)改善影響較大.目前，對發(fā)酵過程中菌種的作用效果的研究還較少，大部分研究集中在自然發(fā)酵上，其發(fā)酵后米粉產(chǎn)品仍然存在安全性及質(zhì)量穩(wěn)定性等問題，因此，尋找大米適宜的改性方法來提高米粉的品質(zhì)已成為重要的研究課題[3].為此，作者采用了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）純種發(fā)酵[4].植物乳桿菌是同型發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵過程中只產(chǎn)生乳酸，是典型的兼性厭氧菌，有很強的發(fā)酵碳水化合物的能力，較耐鹽[5].利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種有用代謝產(chǎn)物，其培養(yǎng)基成分種類繁多，各成分間的相互作用也錯綜復(fù)雜.因而，微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化就顯得尤為重要.多種優(yōu)化方法已開始廣泛地應(yīng)用，其中以響應(yīng)面法的效果最為顯著.響應(yīng)面法是綜合試驗分析和數(shù)學(xué)建模最經(jīng)濟合理的試驗設(shè)計方法[6].常用于描述單個試驗變量對響應(yīng)值的影響、確定試驗變量之間的相互關(guān)系、描述所有試驗變量對響應(yīng)值的綜合影響，彌補了以前在微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方面的不足.作者在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，再用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析，獲得了植物乳桿菌發(fā)酵大米的較佳條件，為提高米粉條(片)的品質(zhì)及技術(shù)改進(jìn)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌CGMCC 1.555菌株由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供.秈碎米：2011年產(chǎn)于河南省信陽.

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂奶粉120 g/L，蒸餾水配制，混勻后分裝，115℃蒸氣滅菌30 min.

MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g/L，葡萄糖 5.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸二銨2.0 g/L，Tween-80 1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO35.0 g/L（配固體培養(yǎng)基時另加瓊脂15.0 g/L），蒸餾水配制，調(diào) pH 6.8，121℃蒸氣滅菌20 min.

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA1204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；PYX-DHS-40X50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；顯微鏡：日本尼康公司；101FAR-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與增殖

將保存于實驗室的植物乳桿菌接種到滅過菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)48 h.待脫脂乳培養(yǎng)基胨化后，再將植物乳桿菌接種到新鮮的脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng).待菌體生長穩(wěn)定后，再將植物乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)48 h.取出斜面培養(yǎng)基，用接種環(huán)在無菌條件下挑取植物乳桿菌單菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)24～48 h.取對數(shù)期菌種的純培養(yǎng)物，加20%甘油在-70℃下保藏菌種.平板、斜面培養(yǎng)基的菌種見圖1、圖2，顯微鏡下的菌種見圖3.

圖1 平板菌落

圖2 斜面培養(yǎng)基的菌種

圖3 植物乳桿菌顯微照片

1.3.2 菌懸液的配制

把活化增殖培養(yǎng)后的植物乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30℃下培養(yǎng)24～48 h，直至乳酸菌的濃度達(dá)到5×108cfu/mL，此菌懸液的照片見圖4.

圖4 菌懸液

1.3.3 大米發(fā)酵條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)［7-8］發(fā)酵條件，取大米150 g，用蒸餾水沖洗后放入已滅菌的裝有無菌水的三角瓶中，大米與無菌水的比例為 1∶2（M/V）.吸取上述菌懸液接種到三角瓶中，密封后，分別在不同條件下發(fā)酵培養(yǎng).

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌生長的影響

按3.3%(V/V)的接種量取10 mL菌懸液接種，然后把培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)整為7.0，分別在22、27、32、37、42 ℃下密封培養(yǎng)，用平板菌落計數(shù)記錄菌體濃度的變化[9]，每天取樣1次，連續(xù)測定7 d.每個處理做3個重復(fù)，取平均值，以確定菌種最適生長溫度.

1.3.3.2 初始pH值對植物乳桿菌生長的影響

按3.3%(V/V)的接種量取10 mL菌懸液接種，然后把培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)整為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在 37℃的條件下密封培養(yǎng)，用平板菌落計數(shù)記錄菌體濃度的變化，每天取樣1次，連續(xù)測定7 d.每個處理做3個重復(fù)，取平均值，確定菌種最適初始pH值.

1.3.3.3 接種量對植物乳桿菌生長的影響

按 2%、3%、4%、5%、6%(V/V)的接種量將菌懸液接入到三角瓶中，然后把培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)整為7.0，在37℃的條件下密封培養(yǎng)，用平板菌落計數(shù)記錄菌體濃度的變化，每天取樣1次，連續(xù)測定7 d.每個處理做3個重復(fù)，取平均值，確定菌種最適接菌量.

1.3.3.4 響應(yīng)面分析優(yōu)化

單因素試驗分別對培養(yǎng)溫度、起始pH、接種量對植物乳桿菌的菌體生長情況進(jìn)行了考察，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以菌體濃度為響應(yīng)值，以培養(yǎng)溫度、起始pH、接種量為變量.參照文獻(xiàn)［10］，利用Design-Expert 7.1.6軟件設(shè)計旋轉(zhuǎn)中心組合試驗，共15組，其中12個為析因點，3個為零點以估計誤差，重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對菌種的影響（表1）

表1 培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌生長的影響 lg(C/(cfu·m L-1))

溫度對發(fā)酵液中的菌體生長速率有顯著影響.溫度對微生物生長的影響包括：一是影響細(xì)胞膜的流動性從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出；二是溫度主要通過改變酶反應(yīng)速率來影響微生物的生長，一般情況下隨著培養(yǎng)溫度的升高酶反應(yīng)速率增大，生長代謝加快，生產(chǎn)期提前.但酶本身很容易因為過熱而失去活性，表現(xiàn)為菌體衰老，最終影響產(chǎn)量，所以研究溫度對菌體生長的影響非常必要.由表1可知，從每天的發(fā)酵來看，隨著溫度的升高，活菌數(shù)都是先增加后減小，不同溫度的活菌數(shù)含量存在顯著差異（除第4天外），且都是在37℃時活菌數(shù)最高.這表明在37℃時植物乳桿菌的代謝最活躍，分裂最旺盛.從每個恒定的溫度來看，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，菌體的濃度都是先增加后減小，且在第3天時達(dá)到最大.由此可知，植物乳桿菌的最適生長溫度為37℃，發(fā)酵3 d時菌體最活躍.此時，菌種的活性最大，對大米中的碳水化合物的發(fā)酵能力最強，在此條件下發(fā)酵的大米做出來的米粉外觀潔白透亮，黏彈性較好，而且還有一定的米香味，長時間發(fā)酵的大米有酸味或者腐臭味.

2.2 初始pH值對菌種的影響（表2）

培養(yǎng)基pH值對微生物的生長有顯著影響，pH值對菌體細(xì)胞膜的電荷情況產(chǎn)生直接影響，進(jìn)而直接制約著菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收.pH值的變化會影響各種酶活，從而影響菌體的生長.培養(yǎng)基初始pH值的變化還會影響接種后菌體生長的延遲期和生長速率以及產(chǎn)物的合成，進(jìn)而最終影響到菌體發(fā)酵大米的能力.由表2可知，從每天的發(fā)酵來看，隨著pH的增加，活菌數(shù)都是先增加后減小，且都是在pH 7.0時活菌數(shù)最高.隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，菌體的濃度先增加后減小，同一培養(yǎng)時間中，不同的起始培養(yǎng)pH值對植物乳桿菌具有較大的影響，組間組內(nèi)差異顯著，且在第3天時菌體濃度達(dá)到最大.由此確定，植物乳桿菌的最適pH為7.0，發(fā)酵3 d時菌體最活躍.此時植物乳桿菌對大米的發(fā)酵利用達(dá)到了最佳，發(fā)酵出來的米粉品質(zhì)也較好.

2.3 接種量對菌種的影響（表3）

接種量直接制約著植物乳桿菌對大米的發(fā)酵程度.當(dāng)接菌量較大時，微生物能充分利用營養(yǎng)物質(zhì)從而縮短生長的延遲期，但與此同時會使微生物生長過快，消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，反而影響后期的生長.接種量較小會使微生物的生長速度變得緩慢，使發(fā)酵液中含菌量過低，培養(yǎng)時間延長，不符合經(jīng)濟利益.因此接種量的多少應(yīng)該根據(jù)實際情況而定.由表3可知，在發(fā)酵第1天，菌體濃度隨著接種量的增大而增大；從發(fā)酵第2天開始，隨著接種量的增加，菌體的濃度都是先增加后減小，且都是在接種量5%時菌體的濃度最高，隨著發(fā)酵的天數(shù)增加，菌體的濃度先增加后減小，不同接種量間的活菌數(shù)含量存在顯著差異，且在第3天時菌體濃度達(dá)到最大.由此確定，植物乳桿菌的最佳接種量為5%，發(fā)酵3 d時菌體最活躍.對大米的發(fā)酵較充分，發(fā)酵出來的米飯品質(zhì)的口感也較好.

表2 起始pH對植物乳桿菌生長的影響 lg(C/(cfu·m L-1))

表3 接種量對植物乳桿菌生長的影響 lg(C/(cfu·m L-1))

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌的發(fā)酵條件

2.4.1 用響應(yīng)面法確定最佳值域

按1.3.3中的試驗方法，運用響應(yīng)面設(shè)計法對植物乳桿菌發(fā)酵條件進(jìn)行尋優(yōu)，試驗因素設(shè)計見表4，試驗方案及結(jié)果見表5.

2.4.2 二次回歸擬合及方差分析

利用Design-Expert 7.1.6軟件對表5的響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到的模型為多項回歸方程.選擇對響應(yīng)值影響顯著的各項，得到多項回歸方程：Y=1 110.33-20.25A+31.00B-31.75C+166.00

AB+40.00AC-100.00BC-125.17A2-107.17B2-23.17C2.為了檢驗方程的可靠性，對該方程進(jìn)行顯著性驗證和方差分析，結(jié)果見表6.

由表6可知，顯著性水平P=0.005 4，表明該模型影響顯著，植物乳桿菌在不同發(fā)酵條件下的差異顯著.失擬項P=0.674 1>0.05，表明失擬項不顯著，模型的預(yù)測值與實際值擬合效果很好.模型的相關(guān)系數(shù)R2=96.01%，大于90%，說明菌體濃度與培養(yǎng)溫度、起始pH和接種量存在線性相關(guān)，表明該模型可解釋菌體濃度的變化.因此該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)面之間的真實關(guān)系，可利用該回歸方程預(yù)測發(fā)酵條件對菌體濃度的影響.

表4 Box-Behnken中心組合設(shè)計

表5 Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果

表6 二次回歸模型的方差分析結(jié)果

2.4.3 采用快速“等高法”尋最優(yōu)值

在回歸模型方差分析的基礎(chǔ)上，利用軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，考察所擬合的對應(yīng)曲面形狀，培養(yǎng)溫度、起始pH和接種量對菌體濃度影響的等高線和相應(yīng)的響應(yīng)面如圖5—圖7所示.等高線的形狀反映交互效應(yīng)強弱的大小，圓形表示兩交互作用不顯著，橢圓形表示兩交互作用顯著[10].

根據(jù)響應(yīng)曲面所具有的特性，在盡可能減少試驗次數(shù)的條件下，利用快速“等高法”既能改善現(xiàn)有試驗水平，又甚至接近最優(yōu)點[11]；它僅需要一個上升方向的估算，而不需要精確計算整個曲面，因此可以大大減少試驗次數(shù).

2.4.3.1 起始pH和培養(yǎng)溫度對菌體濃度的影響由圖5可知，當(dāng)接種量取零點值時，隨著起始pH的增加，培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌的菌體濃度的影響是先增加后減少，且有最大值；同理隨著培養(yǎng)溫度的增加，起始pH對植物乳桿菌的菌體濃度的影響也是先增加后減少，且有最大值，起始pH與培養(yǎng)溫度分別在7.0左右和37℃左右達(dá)到最大值.且起始pH與培養(yǎng)溫度的等高線近似橢圓形，所以起始pH與培養(yǎng)溫度交互作用較顯著.

2.4.3.2 接種量和培養(yǎng)溫度對菌體濃度的影響

由圖6可知，當(dāng)起始pH取零點值時，隨著接種量的增加，培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌的菌體濃度的影響是先增后減，且有最大值；同理隨著培養(yǎng)溫度的增加，接種量對植物乳桿菌的菌體濃度的影響也是先增后減，且有最大值，接種量與培養(yǎng)溫度分別在5%左右和37℃左右達(dá)到最大值，且接種量和培養(yǎng)溫度的等高線接近圓形，可見，接種量與培養(yǎng)溫度交互作用不太顯著.

2.4.3.3 接種量和起始pH對菌體濃度的影響

由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度取零點值時，隨著接種量的增加，起始pH值對植物乳桿菌的菌體濃度的影響是先增后減，且有最大值；同理隨著起始pH值的增加，接種量對植物乳桿菌的菌體濃度的影響也是先增后減，且有最大值，接種量與起始pH分別在5%左右和7.0左右達(dá)到最大值，且接種量和起始pH的等高線近似橢圓形，可見，接種量和起始pH交互作用較顯著.

2.4.3.4 優(yōu)化結(jié)果

由圖5—圖7可知，響應(yīng)面的開口都向下，均存在極大值.由軟件處理后可得優(yōu)化結(jié)果：培養(yǎng)溫度38.01℃，起始pH 7.25，接種量 4.03%，此時菌體濃度達(dá)到理論最大值1 156.51×105cfu/mL.

2.5 驗證試驗

用植物乳桿菌在此條件下發(fā)酵大米：培養(yǎng)溫度38℃，起始pH 7，接種量4%時，對理論值進(jìn)行驗證，此時菌體濃度可達(dá)到最大值1 148×105cfu/mL，與理論值相符.此時的米粉潔白透亮，有較好的黏彈性，筋道且有咬勁，食用品質(zhì)較好.培養(yǎng)條件優(yōu)化后，得到的活菌數(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.2倍.

圖6 接種量和培養(yǎng)溫度的交互作用對菌體濃度的影響

圖7 接種量和起始pH的交互作用對菌體濃度的影響

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化和試驗驗證，獲得植物乳桿菌發(fā)酵大米的最適宜條件：培養(yǎng)溫度38℃，起始pH 7，接種量4%時，此時菌體濃度可達(dá)到最大值1 148×105cfu/mL，與理論值相符，得到的活菌數(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.2倍.

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