生物法制備甲殼素與殼聚糖探討

胡曉冰

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開封 475004）

0 引言

甲殼素（chitin）學(xué)名為聚（1，4）－2－乙酰氨基－2－脫氧－β－D－葡萄糖，又名甲殼質(zhì)、殼多糖、幾丁質(zhì)、蟹殼素、明角殼蛋白、蟲膜質(zhì)、不溶性甲殼質(zhì)、聚乙酰氨基葡萄糖等， 是一種重要的天然高分子化合物，也是多糖化合物中最重要的一種聚氨基葡萄糖。 甲殼素因主要來源于節(jié)肢動(dòng)物（如蝦、蟹等的甲殼）而得名。 殼聚糖（Chitosan）學(xué)名為聚（1，4）－2－氨基－2－脫氧－β－D－葡萄糖， 是甲殼素脫乙酰化而得到的一種生物高分子，是甲殼素的最重要的衍生物，又稱脫乙酰幾丁質(zhì)、聚甲殼糖、甲殼胺、聚氨基葡萄糖、可溶性甲殼素、黏性甲殼素等。 一般而言，甲殼素N－乙酰脫去55%以后（即N－脫乙酰度在55%以上），就可以稱之為殼聚糖，50%以下的為甲殼素。

甲殼素與殼聚糖是含氮的多糖類物質(zhì)，也是自然界中唯一的天然堿性多糖，因此具有許多獨(dú)特的生物活性，包括組織相容性良好、抗菌抑菌性強(qiáng)、可以生物降解等。 甲殼素與殼聚糖開發(fā)應(yīng)用已涉及工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國(guó)防、化工、環(huán)保、食品、醫(yī)藥、保健、美容、紡織等諸多領(lǐng)域，被現(xiàn)代科學(xué)稱之為繼糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等五大生命要素之后的第六生命要素。 本文主要探討使用生物法制備甲殼素與殼聚糖。

1 生物法制備甲殼素與殼聚糖的研究現(xiàn)狀

1.1 利用細(xì)菌制備甲殼素與殼聚糖

一般來說， 細(xì)菌本身不含有甲殼素與殼聚糖，但可以利用細(xì)菌發(fā)酵來改良傳統(tǒng)的化學(xué)提取法。 傳統(tǒng)的化學(xué)提取主要原料是水產(chǎn)加工廠廢棄的蝦殼和蟹殼， 其甲殼素與殼聚糖的含量一般在15%～40%，蛋白質(zhì)含量為20%～40%，碳酸鈣含量為20%～50%。所以制備甲殼素與殼聚糖的方法就包括脫鹽、脫蛋白、脫色等3 個(gè)步驟，即采用稀鹽酸浸泡，脫去碳酸鈣，用稀氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液進(jìn)行堿煮，脫去蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，用高錳酸鉀或過氧化氫溶液漂白。前兩個(gè)步驟的順序可以互換。 該化學(xué)法的特點(diǎn)是：（1）操作簡(jiǎn)單方便、效率高，但能源和資源消耗較大；（2）加工過程產(chǎn)生大量的酸堿廢液，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，處理費(fèi)用高；（3）在長(zhǎng)時(shí)間酸堿作用下，甲殼素與殼聚糖易發(fā)生解聚、異構(gòu)化、脫乙?；痊F(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不均一。 由于化學(xué)法存在以上諸多缺陷，學(xué)者們開始嘗試使用細(xì)菌來改進(jìn)傳統(tǒng)化學(xué)提取甲殼素與殼聚糖的方法。 例如，Pacheco 等［1］考察了溫度條件對(duì)于從廢棄蝦殼中提取甲殼素與殼聚糖和蝦青素的影響；Choorit 等［2］使用響應(yīng)面法優(yōu)化了乳酸菌發(fā)酵作用對(duì)于蝦殼脫鹽率的影響；Bhaskar 等［3］使用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了Pediococcus acidolactici CFR2182 對(duì)于蝦、蟹殼脫蛋白、脫鹽和回收蝦青素的條件；周湘池等［4］使用乳酸桿菌發(fā)酵蝦蟹殼生產(chǎn)甲殼素與殼聚糖；李磊等［5］以共附生乳酸菌發(fā)酵蝦頭、蝦殼，在發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)被蝦頭內(nèi)源蛋白酶液化，得以回收，大部分礦物質(zhì)被乳酸溶解脫除。 這些方法都是使用乳酸菌對(duì)回收蝦、蟹殼中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸和產(chǎn)蛋白酶，再利用稀鹽酸來溶解碳酸鈣及其他不溶鹽，利用蛋白酶來溶解蛋白質(zhì)，最后得到甲殼素與殼聚糖。

1.2 利用真菌來制備甲殼素與殼聚糖

1.2.1 利用真菌菌絲來制備甲殼素與殼聚糖

自然界中，除少數(shù)真菌外，其他真菌均含有甲殼素與殼聚糖。 因?yàn)榧讱に嘏c殼聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要組成，特別是在子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、藻類綱及半知菌綱等真菌細(xì)胞壁中，其含量是十分可觀的（甲殼素／殼聚糖含量為菌體干重的20%～22%）。 例如，曹健等［6］用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖， 獲取率為9.72%。 其培養(yǎng)基為含葡萄糖、玉米漿培養(yǎng)液，另加入Mg2＋，得到的殼聚糖相對(duì)分子量為8.02×104，水分為8.38%，灰分為9.24%；王云陽(yáng)等［7～8］分別用藍(lán)色犁頭霉和魯氏毛霉發(fā)酵制備甲殼素與殼聚糖， 使用藍(lán)色犁頭霉發(fā)酵最優(yōu)條件為：溫度25 ℃，發(fā)酵周期48 h，發(fā)酵液pH 值為6.0，搖瓶裝液量75 mL／250 mL，得到甲殼素產(chǎn)量為0.860 g／L， 殼聚糖產(chǎn)量為0.287 g／L；使用魯氏毛霉發(fā)酵，采用培養(yǎng)基組成為：果糖20 g／L， 牛 肉 膏15 g／L，K2HPO40.75 g／L，MgSO41.80 g／L，N－乙酰葡萄糖胺1.54 g／L。發(fā)酵條件為：溫度28 ℃，周期48 h，pH 值5.0，搖瓶裝液200 mL／L。甲殼素產(chǎn)量為1.328 g／L， 殼聚糖產(chǎn)量為0.672 g／L，殼聚糖占菌粉干重的7%。陳世年［9］等選用米根霉作為菌種，在32 ℃、220 rpm 下?lián)u瓶培養(yǎng)72 h，最終殼聚糖獲得率為10.1%（占生物量干重）， 脫乙酰度為92%；陳忻等［10］以經(jīng)過篩選的第三代雅致放射毛霉為原料， 在溫度28 ℃、 搖床轉(zhuǎn)速250 rpm、pH 值為7.4～7.6 條件下培養(yǎng)45 h，發(fā)酵后菌體經(jīng)稀堿加熱脫蛋白， 再用稀酸處理， 提取殼聚糖， 產(chǎn)品產(chǎn)率達(dá)15.68%，脫乙酰度達(dá)90%左右。 但是，上述作法都只是以發(fā)酵甲殼素與殼聚糖為目的， 使用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)，其經(jīng)濟(jì)性很差。 故現(xiàn)在一些學(xué)者將目光又轉(zhuǎn)向了如何利用發(fā)酵工業(yè)中的廢棄菌體進(jìn)行回收甲殼素與殼聚糖。 例如，婁永江［11］從檸檬酸廠的廢黑曲霉菌絲體中制備殼聚糖，得到的干燥殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度為96.82%，獲取率為3.35%。

1.2.2 利用可食用真菌子實(shí)體來制備甲殼素與殼聚糖

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)， 不僅利用真菌菌絲體可以得到甲殼素與殼聚糖， 還可以通過子實(shí)體的提取方法來得到。 可食用真菌是真菌家族的重要組成部分，品種繁多，可大規(guī)模商業(yè)栽培的多達(dá)20 余種。 但可食用真菌并不是所有部分都適宜食用， 例如香菇,在加工過程中,約占子實(shí)體25%的香菇梗被切除， 得不到利用。 據(jù)報(bào)道, 香菇梗中含蛋白質(zhì)15.28%， 脂肪1.40%， 膳食纖維48.3%， 礦物質(zhì)4.27%，據(jù)微生物學(xué)分析，膳食纖維中含大量的甲殼素與殼聚糖。 為開發(fā)香菇梗這一資源，江龍法［12］探討了用香菇梗制備甲殼素與殼聚糖方法。 他利用香菇梗結(jié)合簡(jiǎn)單的提取甲殼素與殼聚糖工藝流程，得到了脫乙酰度達(dá)78%的殼聚糖產(chǎn)品。 不僅可以通過液態(tài)發(fā)酵方法來生成殼聚糖， 用固態(tài)發(fā)酵方法同樣可以得到殼聚糖產(chǎn)品。 陳凡等［13］利用對(duì)糙皮側(cè)耳固體發(fā)酵菌絲的斷裂繁殖， 定量測(cè)定了其細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征物——?dú)ぞ厶窃跀嗔逊敝尺^程中的變化情況。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得了兩個(gè)結(jié)論：（1）固體發(fā)酵菌絲斷裂繁殖可促使菌絲生長(zhǎng)量顯著增加；（2）斷裂繁殖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)效果不能無限制地延續(xù)， 這可能與培養(yǎng)基中某種營(yíng)養(yǎng)成分的耗盡有關(guān)。

2 生物法制備甲殼素與殼聚糖的特點(diǎn)

2.1 特點(diǎn)

生物法與化學(xué)法制備甲殼素與殼聚糖特點(diǎn)比較結(jié)果如表1 所示：

表1 生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法比較Table 1 Comparison of chitin and chitosan production methods

從表1 可以看出， 生物法制備甲殼素與殼聚糖的主要特點(diǎn)就是：（1）生產(chǎn)原料來源廣泛，真菌法可以利用許多工業(yè)、農(nóng)業(yè)的下腳料，比如麩皮、秸稈、廢糖蜜、玉米餅等等；（2）生產(chǎn)成本低，特別是細(xì)菌法，不需要大量的化學(xué)試劑， 真菌法也不再使用去除不溶鹽的試劑；（3）不污染環(huán)境。

2.2 生物法制備甲殼素與殼聚糖推廣應(yīng)用時(shí)的問題及對(duì)策

利用生物技術(shù)制備甲殼素與殼聚糖目前還處于研究階段，并沒有大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用或生產(chǎn)，其主要原因是：（1）生物法制備比化學(xué)法周期要長(zhǎng)，需要增加一些設(shè)備， 因而直接或間接地提高了生產(chǎn)成本；（2）生物法制備所需要的菌種目前還不完善，真菌中甲殼素與殼聚糖的理論最大含量45%～55%很難達(dá)到；（3）沒有專門的高產(chǎn)甲殼素與殼聚糖的廉價(jià)培養(yǎng)基，所得產(chǎn)品的分子量低，獲取率低。 這些都是限制生物技術(shù)制備甲殼素與殼聚糖的問題。 想要解決以上問題，需要采取以下措施：（1）在生產(chǎn)甲殼素與殼聚糖時(shí)，對(duì)原料進(jìn)行綜合利用，不浪費(fèi)有效資源（例如，在使用乳酸菌發(fā)酵制備甲殼素與殼聚糖的時(shí)候，注意回收蛋白質(zhì)、有機(jī)鈣和蝦青素等）；使用真菌制備甲殼素與殼聚糖的時(shí)候，注意蛋白質(zhì)、微生物油脂以及其他有用的發(fā)酵產(chǎn)物綜合回收。（2）對(duì)現(xiàn)有以甲殼素與殼聚糖為單一產(chǎn)物的菌種， 進(jìn)行基因工程改造或者誘變處理， 使經(jīng)過處理的菌種的甲殼素與殼聚糖含量更高，并在此基礎(chǔ)上研究菌種的發(fā)酵特性，以期得到其他有效的發(fā)酵產(chǎn)物， 使其可以更好地被綜合利用。 （3）優(yōu)化現(xiàn)有培養(yǎng)基配方，或者利用新的原料來進(jìn)行甲殼素與殼聚糖的發(fā)酵，提高產(chǎn)率。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述， 用生物法生產(chǎn)甲殼素與殼聚糖污染較小，原料易得，一般不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。隨著生產(chǎn)甲殼素與殼聚糖技術(shù)的不斷完善，相信不久之后，生物法將打破目前這種被動(dòng)局面，取代傳統(tǒng)的化學(xué)方法， 成為生產(chǎn)甲殼素與殼聚糖的主流方法。

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