馬兜鈴水提液對斑馬魚胚胎的致畸作用和心臟毒性的研究

朱淑珍，李銀保，陳纘光，George Q Li，姚美村*

馬兜鈴是傳統(tǒng)中藥之一，中國藥典(2010年版)中記載馬兜鈴為馬兜鈴科植物北馬兜鈴(Aristolochia contorta Bge.)及南馬兜鈴(A.debilis Seib.et Zucc.)的果實。馬兜鈴的化學成分主要為馬兜鈴酸類(馬兜鈴酸Ⅰ，馬兜鈴酸Ⅱ等)和馬兜鈴內(nèi)酰胺(馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ等)［1］等。自從報導馬兜鈴酸類化合物是導致馬兜鈴酸腎病的主要成分［2］后，含馬兜鈴酸的中藥在國際市場上被禁用，但中國藥典(2010年版)仍保留了馬兜鈴、天仙藤和細辛這三味中藥。研究發(fā)現(xiàn)，除馬兜鈴酸腎病外，馬兜鈴屬植物還有致癌性［3－4］，致突變性［3］和生殖毒性［3］等更為廣泛的毒性。為安全用藥考慮，有必要對馬兜鈴的毒性進行更多研究。

近年來，模式生物斑馬魚在藥物毒性研究方面發(fā)揮了越來越重要的作用。由于斑馬魚的早期發(fā)育與人類極為相似，逐漸成為研究相關(guān)發(fā)育疾病基因的最佳模式生物。而斑馬魚胚胎的發(fā)育是全透明的，借助顯微鏡，可以全程觀察和研究其心臟發(fā)育、血液流動狀況及對胚胎的發(fā)育影響。此研究首次以發(fā)育6～8 hpf的斑馬魚胚胎為模型，在對比研究馬兜鈴酸A(AA)的毒性基礎(chǔ)上，進行了馬兜鈴水提液對胚胎的致畸和心臟毒性影響，為進一步完善含馬兜鈴酸類中藥的安全用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

實驗用斑馬魚(Danio rerio)為野生(wild type，WT)AB系，由中山大學生命科學學院斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)提供。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Zebrafish Book［5］。按照 Kimmel 文獻［6］描述對發(fā)育階段分期。整個實驗的操作遵循OECD標準［7］。

1.2 試劑及儀器

馬兜鈴(安徽省亳州市安國藥業(yè)，產(chǎn)地東北)，經(jīng)中山大學王軍老師鑒定，確定為北馬兜鈴Aristolochia contorta Bge.的干燥果實。色譜純乙腈(Honeywell Burdick＆Jackson公司，美國)，二級純水，馬兜鈴酸A(批號:0746－9002，中國藥品生物制品檢定所)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

顯微攝像系統(tǒng)(倒置光學顯微鏡，40×，100×，BDS200，Optec，重慶，中國;CCD，DM200，Optec，重慶，中國)，島津高效液相色譜儀(LC－20AD二元泵，SIL－20A自動進樣器，CTO－20A柱溫箱，SPD－M20A PDA檢測器)

1.3 馬兜鈴水提液的制備

［8］，將藥材粉碎，過60目篩。稱取粉末20 g，加22倍水，煎煮2次，每次1 h，4 000 r/min離心8 min，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，加1 mL DMSO及斑馬魚胚胎培養(yǎng)液(4%CaCl2，10%NaCl，0.3%KCl，1.63%MgSO4)100 mL，4 000 r/min 離 心8 min，取上清即得水提液貯備液。水提液經(jīng)過0.45 μm的微孔濾膜過濾，取20μL上清液注入高效液相色譜儀進行分析。

1.4 樣品溶液的配置

AA貯備液的配制:精密稱取AA適量，加1 mL DMSO，用胚胎培養(yǎng)液稀釋至100 mL，即得AA貯備液。

AA樣品溶液的配置:用胚胎培養(yǎng)液將貯備液稀釋至 1，2，5，10，20，40，80 μg/mL。

馬兜鈴水提液的樣品溶液的配置:將貯備液用培養(yǎng)液稀釋，使其中的 AA 的濃度為0.5，1，2，5，10，20，40，80 μg/mL。

1.5 樣品溶液的毒性分析

AA的毒性分析:在顯微鏡下選取正常發(fā)育的受精后6～8 h(6～8 hpf)的胚胎，按每組30枚胚胎分組，置于不同濃度的AA溶液中，每隔6 h更換新藥1次。以斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中發(fā)育的胚胎為正常對照組，以1%DMSO中發(fā)育的胚胎為系統(tǒng)對照組，使胚胎在28.5℃下發(fā)育，通過倒置光學顯微鏡和CCD對胚胎幾個發(fā)育終點進行觀察并詳細記錄，統(tǒng)計胚胎發(fā)育全過程的死亡以及畸形數(shù)、拍照記錄狀態(tài)，錄像以計數(shù)心率，并計算LC50。

馬兜鈴水提液的毒性分析:在與AA同樣條件下進行馬兜鈴水提液的毒性分析。其中，馬兜鈴水提液組的胚胎發(fā)育至48 hpf時將測試液換為培養(yǎng)液，并繼續(xù)發(fā)育至第5天。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，多組數(shù)據(jù)均值)的方差分析采用Dunnett－t方法，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 馬兜鈴水提液的液相分析和AA含量計算

馬兜鈴水提液經(jīng)HPLC分析(圖1)采用外標法計算得馬兜鈴水提液中AA濃度為84.37μg/mL，即20 g藥粉中含有的AA的含量為8.437 mg(0.042%)。

圖1 馬兜鈴水提液的HPLC－UV色譜圖

2.2 馬兜鈴水提液對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸和致死作用

用AA含量相等的馬兜鈴水提液和AA在同樣條件下處理斑馬魚胚胎，結(jié)果表明，水提液組的胚胎畸形率和死亡率同AA一樣呈濃度(圖2)和時間依賴性。當水提液中AA的濃度為1μg/mL時胚胎的致畸率為16.7%，而相同濃度的AA組的致畸率為12.0%;當AA濃度達到2μg/mL時，胚胎的畸形及死亡率均加重，水提液組的死亡率為86.7%，而對照品組的死亡率僅為10%;水提液高濃度組(40，80 μg/mL)的胚胎在24 h時全部死亡，而AA同樣濃度組直到80 h才死亡。在56 h時，水提液的5，10，20 μg/mL組的斑馬魚胚胎也相繼全部死亡。

圖2 AA對照品及馬兜鈴水提液對斑馬魚胚胎的致畸和致死作用(120 hpf)

采用SPSS軟件中Prohibit方法進行分析，計算得到馬兜鈴水提液的 LC50為1.43μg/mL，AA的LC50為 6.06 μg/mL。

圖3 AA處理后胚胎在72 hpf時的畸形表現(xiàn)。

馬兜鈴水提液和AA對斑馬魚胚胎的致畸毒性表現(xiàn)如下:

(1)胚胎時期:尾部彎曲，卵黃囊(腹部)膨大，腹部出血(圖3E)

(2)幼魚時期:軀干彎曲，圍心囊(圖3D)和卵黃囊膨大(圖3C)，心臟變形、縮小(圖3D)血循環(huán)逐漸衰竭，最后導致死亡。

2.3 馬兜鈴水提液對斑馬魚胚胎心率的影響

分別在50，56，60，84 hpf錄像以計數(shù)心率。由圖4可以看出在不同的時期，當水提液中AA的濃度達到0.5μg/mL及以上時，胚胎的心率較對照組有明顯差異。

圖4 不同濃度馬兜鈴水提液處理后的胚胎在50，56，60，84 hpf時的心率比較

2.4 馬兜鈴水提液對斑馬魚胚胎的發(fā)育抑制作用

馬兜鈴水提液除了具有致畸，致死和心臟毒性之外，還具有明顯的抑制胚胎發(fā)育作用。培養(yǎng)液組的胚胎在60 hpf時就全部孵化，而暴露于含0.5 μg/mL和1μg/mL AA的水提液的胚胎在96 hpf才全部孵化，2μg/mL組存活的胚胎到108 hpf才完全孵化，且在84 hpf才開始出現(xiàn)心臟跳動(圖4)。

3 討論

3.1 馬兜鈴水提液對斑馬魚胚胎的毒性

由馬兜鈴水提液與AA的結(jié)果可以看出，馬兜鈴水提液的毒性要明顯比AA的毒性要強。由于馬兜鈴酸類不是馬兜鈴的唯一有毒成分［9］，在本研究中水提液明顯表現(xiàn)出比AA更強的毒性，那么在許多研究中僅以AA為標志成分來判斷含馬兜鈴酸類中藥炮制或配伍后毒性的研究是不完善的。

此外，馬兜鈴還具有明顯的抑制胚胎發(fā)育作用。在實驗中發(fā)現(xiàn)設(shè)置同樣濃度的馬兜鈴水提液組的胚胎在實驗過程中(6～120 hpf)未出現(xiàn)孵化，無法觀察到是否有畸形表型。因此在本研究中馬兜鈴水提液組的胚胎在接觸藥液42 h(即48 hpf)后就換為胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)到120 hpf以觀察心臟及致畸表型。

在實驗中發(fā)現(xiàn)馬兜鈴水提液在斑馬魚胚胎培養(yǎng)條件下并不穩(wěn)定，經(jīng)過HPLC分析后發(fā)現(xiàn)，若馬兜鈴水提液放置時間超過6 h，那么其中主要成分含量變化較大，超過OECD標準中規(guī)定允許的±20%［7］的范圍，因此在實驗中每隔6 h換一次樣品液，以保證樣品溶液中成分的穩(wěn)定。

3.2 含馬兜鈴酸類藥物對哺乳類胚胎潛在的致畸作用及心臟毒性

以上結(jié)果表明，馬兜鈴水提液以及AA對斑馬魚胚胎的心臟和發(fā)育都產(chǎn)生了明顯毒性。由于斑馬魚的神經(jīng)中樞系統(tǒng)，內(nèi)臟器官，血液及視覺系統(tǒng)等，在基因水平上87%與人類同源。由于胚胎對外界因素和藥物高度敏感，因此，馬兜鈴有可能也會對哺乳動物的胚胎產(chǎn)生明顯毒性。外推到人類，孕婦誤服或不正確使用含馬兜鈴酸的藥物，將會導致對胚胎有很大的危險，建議國內(nèi)同樣禁用任何含馬兜鈴酸的中藥，包括馬兜鈴等仍被中國藥典收錄的藥物。

致謝:感謝中山大學生命科學學院提供野生型斑馬魚(Danio rerio)胚胎，感謝中山大學藥學院王軍副教授在馬兜鈴藥材鑒定方面提供的幫助。

參考文獻:

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［5］ Monte W.The zebrafish book a guide for the laboratory use of zebrafish(Dario rerio)［M］.Edition 4.Printed by the University of Oregon Press，2000:253.

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［7］ OECD.OECD Guideline for the Testing of Chemicals.Draft Proposal for a New Guideline Fish Embryo Toxicity(FET)Test.OECD，Paris.Draft Guideline，2006.

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［9］ 李彪，李曉玫，張翠英，等.馬兜鈴內(nèi)酰胺I對腎小管上皮細胞的損傷作用［J］.中國中藥雜志，2004，29(1):78－83.