二次正交旋轉組合設計優(yōu)化香菇廢菌棒蛋白質的提取工藝

陳海燕，劉青娥，鐘仙龍，肖建中

(麗水學院，浙江麗水323000)

香菇廢菌棒為香菇出菇采集后留下的菌棒。據有關資料和專家研究表明，廢菌棒中有大量的菌絲存在，而菌絲中含有粗蛋白質等營養(yǎng)物質未被利用，具有較高的開發(fā)利用價值［1-2］。近年來，我國食用菌產業(yè)得到快速發(fā)展，目前已成為世界食用菌第一生產國、出口國和消費國。2004年，我國食用菌總產量達1160萬 t，占世界總產量的80%，全球貿易的40%［3］。廢菌棒除部分作為燃料被燒掉外，大多數是長期堆放在菇場四周任其腐爛，有的則傾倒在水塘、溪溝、河水之中，長期浸泡、四處漂流，不僅影響以后種菇的產量和質量，而且造成嚴重的環(huán)境污染，這是擺在環(huán)保面前的一大難題。本文采用二次正交旋轉組合設計對香菇廢菌棒蛋白質提取工藝進行優(yōu)化，其目的旨在為從香菇菌棒中提取蛋白質的工業(yè)化生產提供理論依據，同時還實現了廢棄物資源的再利用，對促進食用菌產業(yè)與環(huán)境和諧具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇939廢菌棒 浙江省麗水市仙都鄉(xiāng)，將其烘干粉碎過40目篩;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、氫氧化鈉、硫酸銨、丙酮、乙醇、鹽酸等 均為分析純。

722型可見分光光度計 上海光譜有限公司;BS210S電子分析天平 北京賽多利斯;HWS-26恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;TDL-40B離心機 湖南星科科學儀器有限公司;GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 江蘇宏凱儀器廠。

表1 四因素二次正交旋轉組合實驗設計因素水平編碼表Table 1 Factors and code levels of experiments

1.2 提取方法

采用堿法從香菇廢菌棒提取蛋白質，其提取方法如下:稱取廢菌棒粉1g于潔凈的錐形瓶中，加入預定量的不同堿濃度的提取液，室溫下靜置10min后，于一定條件下進行提取，離心(3000r/min，15min)，收集上清液，采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量。

1.3 香菇廢菌棒蛋白質提取工藝單因素實驗

1.3.1 堿濃度對蛋白質提取量的影響 分別調節(jié)堿濃度至0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mol/L。稱取1g廢菌棒粉，置于潔凈的錐形瓶中，加入30mL不同堿濃度的提取液，搖勻;室溫靜置10min后于40℃浸提90min，離心分離(3000r/min，15min)，收集上清液，在595nm下測定蛋白質含量。

1.3.2 浸提溫度對蛋白質提取量的影響 稱取1g廢菌棒粉于錐形瓶中，加入30mL 0.12mol/L的提取液，搖勻;室溫靜置 10min 后，分別在 4、10、20、30、40、50、60、70、80℃不同的溫度下浸提 90min，離心收集上清液，在595nm下測定蛋白質含量。

1.3.3 浸提時間對蛋白質提取量的影響 稱取1g廢菌棒粉，于潔凈的錐形瓶中，加入30mL、0.12mol/L的提取液，室溫靜置10min后，在70℃下分別浸提30、60、90、120、150、180min，離心收集上清液，用于蛋白質含量測定。

1.3.4 液固比對蛋白質提取量的影響 稱取1g廢菌棒粉于錐形瓶中，分別按 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1 液固比加入堿濃度為0.12mol/L的提取液，室溫靜置10min，在70℃下提取90min，離心收集上清液，在595nm下測定蛋白質含量。

1.4 四因素二次正交旋轉組合設計

在以上單因素實驗基礎上，選擇影響蛋白質提取量的四個主要因素堿濃度、浸提溫度、液固比、浸提時間的實驗水平，以香菇廢菌棒蛋白質提取量為考察指標，采用4因子2次正交旋轉組合設計(全實施)，優(yōu)化香菇廢菌棒中蛋白質提取工藝的最佳參數，其因素水平編碼表見表1。

1.5 蛋白質含量的測定

香菇廢菌棒提取液中蛋白質含量的測定采用Bradford檢測法［4］。以結晶牛血清白蛋白為標準蛋白通過考馬斯亮藍G250染色法制定標準曲線，得回歸方程y=4.8094x+0.0113(x為蛋白質(mg)，y為吸光值)，R2=0.9957。同法測定樣品提取液中蛋白質吸光值，根據回歸方程計算香菇廢菌棒蛋白質質量。

香菇廢菌棒蛋白質提取量(mg/g廢菌棒粉)=蛋白質質量(mg)/廢菌棒粉質量(g)

1.6 統(tǒng)計方法及分析軟件

采用4因子2次正交旋轉組合設計，利用DPS9.50分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 堿提過程中各單因素對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響

2.1.1 不同堿濃度對蛋白質提取量的影響 由圖1可知，在堿濃度為0.02～0.16mol/L范圍內，隨著堿濃度的提高，蛋白質提取量明顯上升，當堿濃度為0.16mol/L時，其蛋白質提取量達到最大，為1.930mg/g。這表明，提高堿濃度有利于蛋白質提取量的提高，為了獲得較高得率，應選擇較高的堿濃度。但是堿濃度過高，可能會破壞蛋白質的生物活性，使其變性。且有研究表明，堿性太強可引起脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應，將氨基酸轉變?yōu)橛卸净衔铮?］。因此本實驗選擇0.12mol/L為最佳的堿濃度。

圖1 堿濃度對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響Fig.1 Effect of alkali concentration on yield of protein in Lentinus edodes waste

2.1.2 浸提溫度對蛋白質提取率的影響 浸提溫度對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響如圖2所示。在4～70℃，隨著溫度的升高，蛋白質提取量也在不斷增加。當浸提溫度為70℃時，香菇廢菌棒蛋白質提取量達到最大，為1.22mg/g。但當溫度高于70℃時，蛋白質的提取量反而隨溫度升高而下降。這可能是由于細胞溶脹破碎的程度隨溫度升高而增加，溫度過低不利于蛋白質的溶出，但溫度過高容易引起蛋白質的變性，破壞蛋白質結構和生物學活性。綜合考慮能效比，選擇70℃為最佳的浸提溫度。

2.1.3 浸提時間對蛋白質提取量的影響 由圖3可知，浸提時間越長，蛋白質的得率越高。當時間超過90min后，得率增加量變小，即再延長浸提時間，得率也不會有較大增加。綜合考慮能源稍耗、生產周期、生產成本，浸提時間不宜延長。因此本實驗最佳的浸提時間為90min。

圖2 浸提溫度對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of protein in Lentinus edodes waste substrate

圖3 浸提時間對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of protein in Lentinus edodes waste substrate

2.1.4 液固比對蛋白質提取量的影響 將香菇廢菌棒粉放入不同比例的浸提液中，研究液固比對蛋白提取量的影響，結果如圖4所示。在液固比為10∶1～50∶1范圍內，蛋白質提取量開始隨加液量增加而增加。當液固比為10∶1時，蛋白提取量為0.65mg/g，遠低于其它實驗組，這可能是由于香菇廢菌棒中含有一定量的纖維，具有較強的吸水膨脹能力，使物料因流動性差而難于攪拌，導致蛋白提取量過低［6］。液固比為50∶1時，蛋白質的提取量最大，為1.33mg/g，但當繼續(xù)增加堿液量至液固比達到55∶1后，提取量開始逐漸降低。

圖4 液固比對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響Fig.4 Effect of ratio of solvent to material on yield of protein in Lentinus edodes waste

2.2 二次正交旋轉組合設計優(yōu)化香菇廢菌棒蛋白提取工藝

2.2.1 實驗結果 在以上單因素實驗基礎上，以香菇廢菌棒蛋白質提取量為考察指標，采用4因子2次正交旋轉組合設計(全實施)，優(yōu)化香菇廢菌棒中蛋白質提取工藝的最佳參數。每個因素5個水平，共36個組合，實驗結果見表2。

表2 二次正交旋轉組合實驗設計及實驗結果Table 2 Design and results of experiments

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗 采用DPS9.5統(tǒng)計軟件對表2的數據進行分析，得香菇廢菌棒蛋白質提取量與各因子之間的回歸方程為:

Y =2.14342 +0.07883X1+0.14208X2+0.07008X3-0.05969X12+0.00856X22-0.04906X32-0.02912X3X4。經二次回歸方程分析表明(如表3)，堿濃度和溫度的一次項均達到了極顯著水平(p＜0.01);浸提時間的一次項和二次項，以及堿濃度二次項達到了顯著水平(p＜0.05);而液固比以及四因素間的交互作用無顯著性差異(p＞0.05)。由于設計具有正交性，各回歸系數之間無相關性，因此可直接剔除模型中的不顯著項建立回歸方程。因此，剔除不顯著項后，簡化后的回歸方程為:Y=2.14342+0.07883X1+0.14208X2+0.07008X3+0.05100X4-0.05969X12-0.04906X32。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Sequential model sum of squares

為檢驗回歸方程的有效性，對回歸方程進行失擬性檢驗。由表 3可知，失擬項不顯著(F1=2.19357，p＞0.05)，即回歸方程對實驗點擬合較好?；貧w方程達到極顯著水平(F2=4.42724，p＜0.01)，即實驗所選擇的四個因素對香菇廢菌棒中蛋白質溶出效果有顯著的影響，由此可以認為上面給出的二次回歸方程模型是合適的。

2.2.3 主因素效應分析

由表3可知，各因素對蛋白質提取量的影響從大到小的排序為溫度＞堿濃度＞浸提時間＞液固比。因此調控好這四個主要因素各自的最佳提取范圍，就能有效的提高香菇廢菌棒蛋白質的提取量。

2.2.4 單因素效應分析 將其他因素固定在零水平條件下，分別研究 X1(堿濃度)、X2(浸提溫度)、X3(浸提時間)及X4(液固比)對蛋白質提取量的影響(圖5)。

圖5 各因素對香菇廢菌棒蛋白質提取量的影響Fig.5 Effect of single factor on yield of protein in Lentinus edodes waste substrate

在-2≤Xi≤2的范圍內，溫度和液固比與可溶性蛋白質得率的關系接近線性，表明這兩個因素作用顯著，隨著溫度和液固比的增加，有利于香菇廢菌棒蛋白質得率的提高;時間和堿濃度與蛋白質得率均呈開口向下的拋物線關系，表明兩因素均存在一個合理范圍，即對蛋白質提取量影響都呈先上升后下降的趨勢。

2.2.5 香菇廢菌棒蛋白質提取工藝條件的優(yōu)化與驗證 通過模型對最優(yōu)堿濃度、浸提溫度、浸提時間及液固比進行預測，得出最優(yōu)提取條件為堿濃度0.11mol/L，浸提溫度72℃，浸提時間104min，液固比47∶1，在此條件下蛋白質得率2.38mg/g。根據得到的最優(yōu)工藝參數，開展3次平行驗證實驗，得到的實測值為2.42mg/g，與預測值僅差0.04mg/g，驗證結果顯示方程預測性很好，與實際的偏差較小，說明此最佳模型是可靠的。

3 結論

堿溶液提取蛋白質具有提取率高、成本低的優(yōu)點，適于工業(yè)化生產［7-8］。本文通過單因素實驗和二次正交旋轉組合設計，優(yōu)化了香菇廢菌棒蛋白質提取工藝。通過建立回歸模型，綜合各項模型擬合指標，本研究選用了二次模型來擬合本實驗。經二次回歸方程分析表明，堿濃度和溫度的一次項均達到了極顯著水平，浸提時間的一次項和二次項，以及堿濃度和溫度的二次項達到了顯著水平;而液固比以及四因素間的交互作用無顯著性差異。對二次模型的主效應進行分析，排列出了四因素之間主次關系的順序，依次為溫度＞堿濃度＞浸提時間＞液固比。

另外，本研究使用了統(tǒng)計優(yōu)選方法，對二次模型進行了尋優(yōu)，最終確定了香菇廢菌棒蛋白質得率的最優(yōu)組合為堿濃度0.11mol/L，浸提溫度72℃，浸提時間104min，液固比47∶1。在該條件下實驗，重復三次，所得的蛋白質提取量平均值為2.42mg/g，與模型預測值僅相差0.04mg/g，說明該模型與實驗相吻合，所優(yōu)化的工藝參數準確可靠、穩(wěn)定、可行，能夠適用于生產實踐。

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