菠蘿蜜蛋白酶提取方法的比較研究

徐志霞，黃偱吟，紀(jì)明慧，陳賢珍，卞先蓉，郭宇秀，王銳萍，*

(1.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南海口571158;2.海南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，海南?？?71158)

菠蘿蜜(Artoarpus heterophyllus Lam)，又稱樹(shù)菠蘿、木菠蘿，原產(chǎn)印度和馬來(lái)西亞，目前在我國(guó)的海南、廣東、廣西、臺(tái)灣、福建等地均有種植。菠蘿蜜樹(shù)株產(chǎn)果實(shí)可達(dá)百千克，且果實(shí)碩大，重5～35kg，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有碳水化合物、糖分、蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、氨基酸以及對(duì)人體有用的各種礦物質(zhì)［1］。其中菠蘿蜜的果皮、果肉和種子中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為鮮質(zhì)量的4.24%、2.43%、10.49%，而且菠蘿蜜果實(shí)中的蛋白質(zhì)含量是其它常見(jiàn)水果的2～8倍。目前菠蘿蜜的價(jià)值并沒(méi)有得到廣泛的開(kāi)發(fā)利用，缺乏成熟的配套技術(shù)，除果肉和種子作為食品開(kāi)發(fā)外，菠蘿蜜的經(jīng)濟(jì)效益不高，制約了菠蘿蜜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。菠蘿蜜蛋白酶表現(xiàn)出對(duì)酪蛋白較高的水解活性，可用于肉的嫩化、啤酒的澄清等日化行業(yè)中，在醫(yī)學(xué)上可作抗水腫和消炎藥物，口服可加強(qiáng)體內(nèi)纖維蛋白的水解作用，將阻塞于組織中的纖維蛋白及血凝塊溶解［2］。若對(duì)菠蘿蜜蛋白酶進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，則可大大豐富植物蛋白酶市場(chǎng)，這對(duì)于促進(jìn)菠蘿蜜種植業(yè)與加工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。蛋白酶的提取方法很多，如鹽析法、層析法、電泳、超濾等技術(shù)，本研究以菠蘿蜜果肉為材料，選擇工藝較簡(jiǎn)單的乙醇法、硫酸銨沉淀法和氯化鈉沉淀法進(jìn)行研究和比較，為工業(yè)化生產(chǎn)及進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜(Artoarpus heterophyllus Lam) 海南產(chǎn)，本研究取材于成熟果實(shí)的果肉部分;乙醇、硫酸銨、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、三氯醋酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸、酪蛋白 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TDL-40B臺(tái)式低速大容量離心機(jī) 湖南新科科學(xué)儀器有限公司;7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)、UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 龍尼柯上海儀器有限公司;馬頭牌JYT-2架盤(pán)藥物天平 上海醫(yī)用激光儀器廠;HH-W600數(shù)顯三用恒溫水箱 金壇市金南儀器制造有限公司;UB-10型酸度計(jì) 丹佛儀器(北京)有限公司。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用雙縮脲法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照參考文獻(xiàn)［3］，所得吸光度(y)與蛋白質(zhì)含量(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=8.10993e-4+0.10243x，即 x=9.7599y-0.0076(r=0.9997)。

1.2.2 菠蘿蜜蛋白酶活力測(cè)定［4］菠蘿蜜蛋白酶活力單位定義:在測(cè)定條件下，每分鐘酶水解濾液光吸收的增值與1μg酪氨酸在275nm處光吸光值相同時(shí)的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位。

測(cè)定方法為用酪氨酸和蒸餾水配制一系列不同濃度的酪氨酸溶液，于275nm處，測(cè)得吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸直線為:y=-0.0141+0.00698x，y表示為吸光度;x表示酪氨酸的最終濃度(μg/m L)。當(dāng)x為50μg/m L 時(shí)，通過(guò) y=-0.0141+0.00698x，得到y(tǒng)=As=0.335。計(jì)算公式如下:

式中:A表示所提出的蛋白酶在275nm處的吸光值;As表示50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸在275nm處的吸光值(As=0.335);Ws表示標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸的濃度(50μg/L);t表示反應(yīng)時(shí)間(10m in);V表示酶催化水解的體積(4m L);N表示稀釋倍數(shù)。

酶的比活力為酶活力單位與蛋白質(zhì)毫克數(shù)的比值。

1.2.3 菠蘿蜜蛋白酶得率的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)規(guī)定為各種方法在最佳條件下制取的菠蘿蜜蛋白粉與所用菠蘿蜜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比。

1.3 菠蘿蜜蛋白酶的提取方法

新鮮菠蘿蜜→取果肉用組織搗碎機(jī)搗碎→加入一定濃度的抽提液，在一定的pH、溫度、時(shí)間下浸提→過(guò)濾→取上清4000r/min離心20min→取沉淀即得粗酶→測(cè)酶活。

1.4 提取菠蘿蜜蛋白酶的單因素實(shí)驗(yàn)

菠蘿蜜蛋白酶提取工藝的影響因素主要包括提取液濃度、pH、提取溫度、提取時(shí)間，針對(duì)這四個(gè)因素，控制單一變量，考察其對(duì)菠蘿蜜蛋白酶活力的影響。

1.5 提取菠蘿蜜蛋白酶的正交實(shí)驗(yàn)［5］

在不同提取方法的單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以菠蘿蜜蛋白酶的比活力為指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝。乙醇法、硫酸銨沉淀法、氯化鈉沉淀法的正交實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1～表3。

表1 乙醇法提取菠蘿蜜蛋白酶L25(54)正交實(shí)驗(yàn)方案Table 1 The design of L25(54)orthogonal testmethod of alcohol

表2 硫酸銨沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶L25(54)正交實(shí)驗(yàn)方案Table 2 The design of L25(54)orthogonal testmethod of ammonium sulfate precipitation

表3 氯化鈉沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案Table 3 The design of L9(34)orthogonal testmethod of sodium chloride precipitation

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇法提取菠蘿蜜蛋白酶

用組織搗碎機(jī)將菠蘿蜜果肉搗碎，稱取20g菠蘿蜜樣品，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取，確定各單因素提取菠蘿蜜蛋白酶的最佳條件為(結(jié)果未列出):乙醇提取濃度80%，pH7.2，溫度42℃，時(shí)間20min。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表4。

表4 乙醇法提取菠蘿蜜蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal testmethod of alcohol

從表4可以看出，在乙醇濃度升高時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶的活性顯著降低，可能是此時(shí)大部分的蛋白酶已經(jīng)變性。根據(jù)表4可知，4個(gè)因素對(duì)乙醇法提取菠蘿蜜蛋白酶比活力影響的主次順序?yàn)?提取時(shí)間＞pH＞溫度＞乙醇濃度，最佳工藝組合為A1B1C1D1，即 10%濃度乙醇中，10℃條件下，浸提10min，最佳pH為5.0。

2.2 硫酸銨沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶

用組織搗碎機(jī)將菠蘿蜜果肉搗碎，稱取10g菠蘿蜜樣品，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取，確定各單因素提取菠蘿蜜蛋白酶的最佳條件為(結(jié)果未列出):硫酸銨提取濃度17.5%，pH6.0，溫度0℃，時(shí)間35min。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表5。

表5 硫酸銨沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of orthogonal test method of ammonium sulfate precipitation

從表5可以看出，pH對(duì)此方法的影響較大，最適p H為6.8，而溫度和時(shí)間的影響不大，說(shuō)明硫酸銨沉淀法提取的菠蘿蜜蛋白酶的穩(wěn)定性比較好。根據(jù)表5可知，4個(gè)因素對(duì)硫酸銨沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶比活力影響的主次順序?yàn)?pH＞硫酸銨濃度＞溫度＞時(shí)間，最佳工藝組合為A1B3C1D1，即15%濃度硫酸銨中，0℃條件下，浸提15min，最佳pH為6.8。

2.3 氯化鈉沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶

用組織搗碎機(jī)將菠蘿蜜果肉搗碎，稱取10g菠蘿蜜樣品，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取，確定各單因素提取菠蘿蜜蛋白酶的最佳條件為(結(jié)果未列出):氯化鈉提取濃度17.5%，p H5.5，溫度4℃，時(shí)間60min。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表6。

表6 氯化鈉沉淀法提取菠蘿蜜蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of orthogonal test method of sodium chloride precipitation

根據(jù)表6結(jié)果顯示，菠蘿蜜蛋白酶的最適pH在5～6之間，低溫時(shí)操作有利于保護(hù)蛋白酶的活性。由表6可知，4個(gè)因素對(duì)氯化鈉法提取菠蘿蜜蛋白酶比活力影響的主次順序?yàn)?氯化鈉濃度＞溫度＞pH＞提取時(shí)間，最佳工藝組合為A1B2C2D2，即17.5%濃度氯化鈉中，4℃條件下，浸提2h，最佳p H為6.0。

2.4 乙醇、硫酸銨、氯化鈉法提取菠蘿蜜蛋白酶的比較

由表7可以看出，用硫酸銨沉淀法提取的菠蘿蜜蛋白酶得率和酶活力最高，其中得率達(dá)57.18%，分別比乙醇法和氯化鈉沉淀法高出50倍和25倍，而比活力也比乙醇法和氯化鈉法高，所以用硫酸銨沉淀法進(jìn)行菠蘿蜜蛋白酶的提取效果比較好。研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果蛋白酶的工業(yè)提取工藝中酶比活力最高為 2.52U/mg，得率為 52.32%［6］;生姜蛋白酶的工業(yè)提取工藝中酶比活力最高為4.383U/mg，得率為2.3%［7］;無(wú)花果蛋白酶的工業(yè)提取工藝中酶比活力最高為0.29U/mg，得率為47.99%［8］。而本研究中菠蘿蜜蛋白酶的初步提取中，酶比活力最高為6.881U/mg，得率為57.18%，顯著高于其他蛋白酶。

表7 三種提取方法的比較Table 7 Comparision of three extraction methods

3 結(jié)論與討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在菠蘿蜜的果肉、花萼、種子中，果肉提取的蛋白酶得率和酶活最高，因此本實(shí)驗(yàn)選取菠蘿蜜果肉為實(shí)驗(yàn)材料。通過(guò)對(duì)三種方法的比較，硫酸銨沉淀法得率和酶活力較高，但是此工藝操作復(fù)雜，雜質(zhì)較多不易去除，不適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用;氯化鈉法和乙醇法提取蛋白酶的得率較低，酶活力相似，而氯化鈉也不易去除，但乙醇比較容易去除，通過(guò)進(jìn)一步的研究?jī)?yōu)化工藝，可以作為工業(yè)提取的有效方法。但是要在菠蘿蜜產(chǎn)區(qū)進(jìn)行粗酶的加工生產(chǎn)，由于目前還缺乏更多的有關(guān)規(guī)?；崛〔ぬ}蜜蛋白酶的工藝技術(shù)，且本工藝還存在一些未完善的地方，因此有待進(jìn)行更深入的研究。

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