響應(yīng)面法優(yōu)化留胚精米中積累γ-氨基丁酸的發(fā)芽條件

華澤田，劉勝斌，王 芳，孟 夢，趙 飛，張 芹，宛紅穎，謝艷輝

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457;2.國家粳稻工程技術(shù)中心，天津300457)

γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在動植物中廣泛分布。它由L-谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化而來，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［1］。GABA 有調(diào)節(jié)心血管［2］、調(diào)節(jié)神經(jīng)相關(guān)蛋白及酶的表達(dá)［3］、降血壓［4］、抗衰老［5］、促進(jìn)生長素分泌［6-7］等功能，是一種很有研究前景的營養(yǎng)物質(zhì)。目前，水稻中GABA含量的研究主要原料是糙米［8］，糙米的口感影響人們的消費(fèi)。Z601是一種高留胚率的米，其精米留胚率在80%以上。本研究以Z601為原料，通過單因素實驗，響應(yīng)面實驗研究精米中GABA含量與浸泡溫度、浸泡時間、發(fā)芽溫度、發(fā)芽時間4種發(fā)芽條件的關(guān)系，為留胚精米的綜合利用和新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

留胚米Z601 國家粳稻工程技術(shù)中心;γ-氨基丁酸 Sigma-Aldrich Co.LLC;三氯乙酸、次氯酸鈉、醋酸鈉 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;甲醇(色譜純)、乙腈 (色譜純) Merck KGaA Darmstadt Germany;β-巰基乙醇 AMRESCO Inc;鄰苯二甲醛 生工生物(上海)工程有限公司。

高效液相色譜儀LC-10ATVP 日本島津公司;Venusil MP-C18色譜柱(4.6mm×250mm);TE214S電子天平 賽多科斯科學(xué)儀器有限公司;JGJ45糙米機(jī)

杭州錢江儀器設(shè)備公司;Pearlest精米機(jī) 日本KETT科學(xué)研究所;pHS-3C型pH計 天津盛邦科學(xué)儀器技術(shù)有限公司;HYG恒溫?fù)u床 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;HK-02A粉碎機(jī) 廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;針式過濾器 天津博納艾杰爾科技有限公司;一次性使用無菌注射器(1mL) 上海治宇醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 精米發(fā)芽工藝條件及操作要點(diǎn) 工藝流程:原料篩選→去皮成糙米→磨成精米→消毒→清洗→發(fā)芽→干燥→粉碎［8］

操作要點(diǎn):選取籽粒飽滿的稻米，去皮后用Pearlest精米機(jī)處理40s成為精米。為了抑制發(fā)芽后的發(fā)酵味，用1%的次氯酸鈉水溶液洗1min，用滅菌的去離子水反復(fù)沖洗3遍。將處理好的精米用紗布包好，恒溫浸泡，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中發(fā)芽，保持培養(yǎng)皿濕潤，每3h上下翻動一次。發(fā)芽結(jié)束后將培養(yǎng)皿放入55℃烘箱終止活性，干燥一定時間，取出粉碎。

1.2.2 GABA含量測定 樣品準(zhǔn)備:將粉碎后的樣品過60目篩，稱取2g，加入5%三氯乙酸水溶液5mL，30℃振蕩提取2h，離心(轉(zhuǎn)速10000r/min)10min，取上清液待測［9］。

色譜條件:單泵，流速為0.9mL/min;色譜柱為Venusil MP-C18(4.6×250mm)，柱溫30℃;流動相為1.6g NaAc·3H2O溶于 600mL水中，pH7.2，甲醇200mL，乙氰200mL;檢測波長338nm。

衍生化［10］:吸取硼酸緩沖液(0.4mol/L，p H10.4)1000μL，樣品 200μL，OPA 衍生試劑(OPA 80mg，β-巰基乙醇 80μL，乙腈 10mL)200μL，混合均勻，暗室中室溫反應(yīng)5min后進(jìn)樣20μL。

GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:用配制好的250mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋 50、40、30、20、10、6、5 倍，柱前衍生，吸取20μL進(jìn)樣，重復(fù)三次，以GABA的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 浸泡溫度對γ-氨基丁酸含量的影響 將20g精米用一級水浸泡，浸泡溫度分別為15、20、25、30、35、40℃，浸泡 10h，在 25℃條件下發(fā)芽 18h，取出干燥粉碎，分別測定GABA含量。

1.3.2 浸泡時間對γ-氨基丁酸含量的影響 將20g精米用一級水浸泡，浸泡溫度分別為30℃，浸泡時間分別為 4、6、8、10、12、14、16h，在 25℃ 條件下發(fā)芽18h，取出干燥粉碎，分別測定GABA含量。

1.3.3 發(fā)芽溫度對γ-氨基丁酸含量的影響 將20g精米用一級水浸泡，浸泡溫度分別為30℃，浸泡12h，分別在 20、25、30、35、40℃條件下發(fā)芽 18h，取出干燥粉碎，分別測定GABA含量。

1.3.4 發(fā)芽時間對γ-氨基丁酸含量的影響 將20g精米用一級水浸泡，浸泡溫度分別為30℃，浸泡時間分別為 12h，在 30℃ 條件下分別發(fā)芽 6、12、18、24、30h，取出干燥粉碎，分別測定GABA含量。

1.3.5 響應(yīng)面實驗各水平及編碼 根據(jù)單因素實驗的實驗結(jié)果，設(shè)計響應(yīng)面實驗。各因素及編碼見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計各因素水平及編碼Table 1 Variables and levels in response surface design

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert軟件(V8.0.6)對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析，用F值考察模型和各因素的顯著性水平，所有的實驗均做3次重復(fù)，實驗結(jié)果以干基表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 留胚精米發(fā)芽結(jié)果

本實驗組通過對157個水稻品種的精米留胚率進(jìn)行統(tǒng)計，篩選出高留胚率的水稻品種Z601。普通的精米留胚率在50%以下，而Z601精米留胚率在80%以上。經(jīng)過24h的發(fā)芽培養(yǎng)，糙米的出芽率接近100%，普通的精米不發(fā)芽，而Z601精米部分發(fā)芽(圖1)，其發(fā)芽率達(dá)42%，為研究不同發(fā)芽條件對留胚精米中GABA積累的影響提供了可能。

圖1 糙米、留胚精米和普通精米發(fā)芽處理前后對比圖Fig.1 Brown rice，germ-remaining milled rice，common milled rice before and after germination

2.2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為研究GABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與液相色譜峰面積之間的線性關(guān)系，用液相色譜法測定不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，圖2為GABA標(biāo)準(zhǔn)品的液相圖，以信號峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，GABA濃度為橫坐標(biāo)(X)，結(jié)果線性回歸得到回歸方程(圖3):Y=6227.9X+2177.3，R2=0.9995。GABA 最低檢出限為5mg/L。

圖2 GABA標(biāo)品液相圖Fig.2 Chromatogram of standard solution

2.3 單因素實驗結(jié)果分析

圖3 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of GABA

為研究各個因素不同水平下GABA含量的變化規(guī)律，確定每個因素最佳的提取條件，對每個因素不同水平的GABA含量按照上述1.3.1～1.3.4所示的方法進(jìn)行測定，得到以下結(jié)果，見圖4。

圖4 各因素對GABA含量的影響Fig.4 Individual effect on GABA content

在15～30℃范圍內(nèi)，隨著浸泡溫度的上升GABA含量逐漸上升，在30℃時達(dá)到最大值，30～40℃隨著浸泡溫度的上升GABA含量逐漸下降(圖4a)。在4～12h范圍內(nèi)，隨著浸泡時間的增加，GABA含量逐步增加，浸泡時間在12h時GABA含量達(dá)到最大值，12～16h范圍內(nèi)，隨著浸泡時間的增加GABA含量逐漸下降(圖4b)。在20～30℃范圍內(nèi)，隨著發(fā)芽溫度的上升GABA含量逐漸上升，在30℃時達(dá)到最大值，30～40℃隨著發(fā)芽溫度的上升GABA含量逐漸下降(圖4c)。過高或者過低的溫度都不利于GABA積累［12］，溫度過低，種子發(fā)芽緩慢，GABA含量積累慢，溫度過高，酶活性下降，GABA含量積累也會受到影響［13］。在6～24h范圍內(nèi)，隨著發(fā)芽時間的增加，GABA含量逐步增加，浸泡時間在24h時GABA含量達(dá)到最大值，24～30h范圍內(nèi)，隨著發(fā)芽時間的增加GABA含量逐漸下降(圖3d)。隨著發(fā)芽時間的增加GABA含量逐漸下降主要原因是在此過程中GABA在轉(zhuǎn)氨酶的作用下變成了琥珀酸半醛［14］。

因此，各因素最佳的提取條件確定為:浸泡溫度30℃，浸泡時間12h，發(fā)芽溫度30℃，發(fā)芽時間24h。

2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果分析

2.4.1 Box-Behnken實驗方案及結(jié)果 按照Design-Expert軟件(V8.0.6)設(shè)計的四因素三水平實驗方案(表2)，測定不同發(fā)芽條件下精米中GABA含量(圖5)，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析(表3)確定模型及各項的顯著性水平。

圖5 精米樣品液相圖Fig.5 Chromatogram of GABA in the sample

通過分析(見表2)得到GABA含量與各發(fā)芽條件之間的二次多項式模型為:

此模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9946，模型極顯著，失擬項在0.05水平上不顯著(p＞0.05)。R2Adj=0.9893說明該模型能夠解釋98.93%響應(yīng)值的變化，能描述GABA含量隨發(fā)芽條件的變化規(guī)律。其中

X1、X2、X4、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X12、X22、X32、X42對 GABA 含量影響極顯著，X3、X1X2、X3X4對 GABA含量影響不顯著(表3)。所以GABA含量與各發(fā)芽條件之間的二次多項式模型修正為:

2.4.2 兩因素之間的交互作用 由以上得出的模型可以做出響應(yīng)面圖和等高線圖(圖6～圖11)，各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響可以通過組圖直觀的表現(xiàn)出來。等高線圖反映了交互作用的強(qiáng)弱［15］，通過分析等高線圖可以得出每兩個因素中對GABA含量影響較大的因素。

表2 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果Table 2 Process variables and levels in response surface central composite design and experimental results

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regressionmodel

圖6 浸泡溫度(X1)與浸泡時間(X2)對GABA含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.6 Response surface showing the interactive effects of soaking temperature and time on GABA content

浸泡溫度不變時，隨著浸泡時間的延長，GABA含量先升高后下降;當(dāng)浸泡時間不變時，隨著浸泡溫度的上升GABA含量先升高后下降(圖6)。說明過高的浸泡溫度和浸泡時間都不利于GABA含量的積累。

浸泡溫度不變時，隨著發(fā)芽溫度的升高，GABA含量先升高后下降;當(dāng)發(fā)芽溫度不變時，隨著浸泡溫度的上升GABA含量先升高后下降(圖7)。說明過高的浸泡溫度和發(fā)芽溫度都不利于GABA含量的積累。浸泡溫度等高線比發(fā)芽溫度等高線陡峭，說明浸泡溫度對GABA含量影響比發(fā)芽溫度對GABA含量影響要大。

圖7 浸泡溫度(X1)與發(fā)芽溫度(X3)對GABA含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.7 Response surface showing the interactive effects of soaking temperature and germination temperature on GABA content

浸泡溫度不變時，隨著發(fā)芽時間的延長，GABA含量先升高后下降;當(dāng)發(fā)芽時間不變時，隨著浸泡溫度的上升GABA含量先升高后下降(圖8)。說明過高的浸泡溫度和發(fā)芽時間都不利于GABA含量的積累。浸泡溫度等高線比發(fā)芽時間等高線陡峭，說明浸泡溫度對GABA含量影響比發(fā)芽時間對GABA含量影響要大。

浸泡時間不變時，隨著發(fā)芽溫度的升高，GABA含量先升高后下降;當(dāng)發(fā)芽溫度不變時，隨著浸泡時間的延長GABA含量先升高后下降(圖9)。說明過高的浸泡時間和發(fā)芽溫度都不利于GABA含量的積累。浸泡時間等高線比發(fā)芽溫度等高線陡峭，說明浸泡時間對GABA含量影響比發(fā)芽溫度對GABA含量影響要大。

圖8 浸泡溫度(X1)與發(fā)芽時間(X4)對GABA含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.8 Response surface showing the interactive effects of soaking temperature and germination time on GABA content

圖9 浸泡時間(X2)與發(fā)芽溫度(X3)對GABA含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.9 Response surface showing the interactive effects of soaking time and germination temperature on GABA content

浸泡時間不變時，隨著發(fā)芽時間的延長，GABA含量先升高后下降;當(dāng)發(fā)芽時間不變時，隨著浸泡時間的延長GABA含量先升高后下降(圖10)。說明過高的浸泡時間和發(fā)芽時間都不利于GABA含量的積累。浸泡時間等高線比發(fā)芽時間等高線平緩，說明浸泡時間對GABA含量影響比發(fā)芽時間對GABA含量影響要小。

圖10 浸泡時間(X2)與發(fā)芽時間(X4)對GABA含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.10 Response surface showing the interactive effects of soaking time and germination time on GABA content

發(fā)芽溫度不變時，隨著發(fā)芽時間的延長，GABA含量先升高后下降;當(dāng)發(fā)芽時間不變時，隨著發(fā)芽溫度的上升GABA含量先升高后下降(圖11)。說明過高的發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間都不利于GABA含量的積累。

2.4.3 驗證性實驗 經(jīng)過分析，對Z601精米GABA含量最有利的工藝條件為:浸泡溫度31.02℃、浸泡時間12.69h、發(fā)芽溫度30.63℃、發(fā)芽時間27.12h，GABA含量預(yù)測值可達(dá)到31.54mg/100g。為了實驗操作簡便此發(fā)芽工藝條件調(diào)整為浸泡溫度31℃、浸泡時間13h、發(fā)芽溫度31℃、發(fā)芽時間27h。按照調(diào)整后的條件進(jìn)行測定，最終測定的結(jié)果為31.13mg/100g，與預(yù)測值接近。證明了此模型對優(yōu)化精米中GABA含量發(fā)芽條件的可行性。

圖11 發(fā)芽溫度(X3)與發(fā)芽時間(X4)對GABA含量影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.11 Response surface showing the interactive effects of germination time and temperature on GABA content

3 結(jié)論

本研究通過單因素實驗，響應(yīng)面實驗及驗證性實驗得到了GABA含量與浸泡溫度、浸泡時間、發(fā)芽溫度、發(fā)芽時間回歸模型:

Y=-510.10+21.69X1+19.69X2+1.48X4+0.08X X+0.04X X+0.18X X+0.20X X-0.40X2131423241-1.16X22-0.15X32-0.11X42確定了對GABA含量最有利的發(fā)芽工藝條件為浸泡溫度31℃、浸泡時間13h、發(fā)芽溫度31℃、發(fā)芽時間27h，此條件下測定的結(jié)果為31.13mg/100g，是不發(fā)芽條件下精米中GABA含量(7.8mg/100g)的4倍，與預(yù)測值接近。說明了此模型的可行性。目前，國內(nèi)外對稻米中的GABA含量研究主要集中在糙米，對精米中的GABA含量研究鮮有報道，精米比糙米有更強(qiáng)的適口性，因此本研究以留胚精米為原料，為留胚精米新產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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