紅酵母發(fā)酵廢糖蜜產(chǎn)類胡蘿卜素的研究

張秀鳳，辛嘉英，2，* ，暢 樂

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076;2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000)

類胡蘿卜素不僅是理想的食品著色劑和營養(yǎng)增補劑，更重要的是類胡蘿卜素還具有預(yù)防血管硬化、抑制腫瘤發(fā)生、增加宿主免疫力和抗氧化等功能［1-4］。人們越來越意識到類胡蘿卜素這種天然色素的重要作用，盡量降低類胡蘿卜素的生產(chǎn)成本也成為目前學(xué)者主要的研究課題。廢糖蜜是糖廠的副產(chǎn)物。北方地區(qū)盛產(chǎn)甜菜，甜菜糖蜜為甜菜加工量的3%～4%，來源十分豐富［5-6］。糖蜜中含有豐富的酵母，是可以利用的可發(fā)酵性糖［7-9］。但大部分廠家將其廢棄，造成環(huán)境污染［10］。隨著我國制糖工業(yè)的發(fā)展，糖蜜的產(chǎn)量日益增加，進(jìn)行廢糖蜜利用的研究是非常必要的。采用紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素具有營養(yǎng)要求簡單粗放、發(fā)酵周期短、培養(yǎng)方式簡單、營養(yǎng)條件要求低、可高密度培養(yǎng)等優(yōu)點。2004年張坤生研究了番茄醬、花生油對粘紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，類胡蘿卜素產(chǎn)量分別比對照組提高了24.75%和13.1%。2005年Z.Aksu和A.Tugba在粘性紅圓酵母中添加棉籽油和Tween80。甘蔗糖蜜作為碳源可獲得最高色素產(chǎn)量125.0mg/L，乳清乳糖作為碳源時色素產(chǎn)量為35.5mg/g。2008年翟紅梅研究了維生素對粘紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，在培養(yǎng)基中添加 VB10.2mg/L、VB21.0mg/L、VC0.7mg/L 時，類胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá) 12.35mg/L，比對照組提高了9.78%［11-13］。若能利用紅酵母發(fā)酵廢糖蜜生產(chǎn)類胡蘿卜素，不僅可以豐富市場上增色飼料添加劑的種類，而且還能提高廢糖蜜的利用價值，減少由廢糖蜜帶來的環(huán)境污染，從而增加糖廠的經(jīng)濟效益［14-17］。本文研究了紅酵母發(fā)酵廢糖蜜最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝條件，以及發(fā)酵過程中多因素對生物轉(zhuǎn)化量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3mol/L HCl溶液、丙酮溶液 分析純;廢糖蜜 依安糖廠;AS2.2241紅酵母(Rhodotorula sp.)華東理工大學(xué)生物反應(yīng)工程國家重點實驗室交流菌種，以苯乙酮蒸氣為唯一碳源，從土壤中分離篩選獲得，現(xiàn)保存于中國普通微生物保藏中心;斜面培養(yǎng)基配方 葡萄糖 15g/L，蛋白胨 5g/L，瓊脂 20g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，NaCl 1g/L，MgSO40.54g/L，pH6.0，裝量 100mL/250mL 三角瓶，121℃濕熱滅菌20min;種子培養(yǎng)基配方 葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，裝量50mL/250mL三角瓶，pH6.0，121℃濕熱滅菌2 min;發(fā)酵培養(yǎng)基配方 葡萄糖 40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨 10g/L，MgSO41g/L，K2HPO40.5g/L，裝瓶量50mL/250mL三角瓶，pH6.0，121℃濕熱滅菌20min。

Spectrum756P紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;Sigma2-16K低溫冷凍離心機 德國SIGMA公司;Spectrum756P紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HZQ-C空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)基培養(yǎng) 將紅酵母菌株從保存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到斜面活化培養(yǎng)基上，將斜面培養(yǎng)基斜放在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48h。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)基培養(yǎng) 接兩環(huán)斜面培養(yǎng)基的菌種于種子培養(yǎng)基中，28℃振蕩(180r/min)培養(yǎng)48h。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)方法 將種子液按接種量10%接入搖瓶培養(yǎng)基中，于28℃旋轉(zhuǎn)搖床(250r/min)培養(yǎng)120h。

1.2.2 糖蜜預(yù)處理方法 原糖蜜+蒸餾水→稀糖蜜+硫酸(pH3.5～3.8)→石棉網(wǎng)、電爐→保持10min→自然冷卻→常溫放置12h→離心取上清液，棄沉淀→調(diào)節(jié)pH至6。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 紅酵母破壁方法［18］酸熱水解法:向10mL經(jīng)離心(9000r/min，15min)棄上清液后的濕菌體中加入3mol/L鹽酸6mL，室溫振蕩30min，在沸水浴中煮沸4～5min，迅速冷卻。

研磨法:取10mL經(jīng)離心(9000r/min，15min)棄上清液后的濕菌體于研缽中，加入少許石英砂，研磨至粘稠狀，加入10mL丙酮，于50℃水浴中提取1h，取上清液即為色素粗提液。

細(xì)胞自溶法:取 10mL經(jīng)離心(9000r/min，15min)棄上清液后的濕菌體于試管中，加入10倍質(zhì)量的水，并按4%的用量加入NaCl作為質(zhì)壁分離劑，調(diào)p H為6.0～7.0，控制溫度55℃，自溶約3h后以9000r/min離心15 min，所獲沉淀水洗后再離心，即得細(xì)胞碎片。

超聲波破碎法:向 10mL經(jīng)離心(9000r/min，15min)棄上清液后的濕菌體中加入10mL丙酮，于超聲波破碎儀上破碎1h，離心取上清液即為色素粗提液。

超聲波輔助酸熱法:步驟和酸熱水解法相同，在鹽酸浸泡過程中將試管置于超聲波條件下，利用超聲波來輔助破碎細(xì)胞壁。每一種破壁方法結(jié)束之后，向細(xì)胞碎片中加入10mL丙酮作為浸提劑，浸泡30min，9000r/min離心15min，所得上清液即為丙酮的類胡蘿卜素浸提液。

1.2.3.2 色素提取方法［19］采用丙酮提取法，將酸熱破壁后的紅酵母濕菌體與酸溶液混合物在9000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，棄上清液，沉淀用蒸餾水洗滌2次后加入10mL丙酮。室溫下振蕩浸泡1h提取類胡蘿卜素，然后于9000r/min離心15min得上清液即為類胡蘿卜素提取液，如細(xì)胞碎片中仍有色素，加丙酮進(jìn)一步提取，合并上清液。將浸提液適當(dāng)稀釋后用756型分光光度計在475nm下測定吸光度值。按式(1)、(2)計算類胡蘿卜素產(chǎn)量:

式中:Aλmax-最大吸收波長475nm下的吸光度;D-測定試樣的稀釋倍數(shù)“1”;V-提取色素用有機溶劑體積(mL);W-單位體積發(fā)酵液中干酵母菌體重量(μg/mL);0.16-類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

每克細(xì)胞的類胡蘿卜素產(chǎn)量(mg/g)=色素產(chǎn)量(mg/L)/細(xì)胞生物量(g/L) 式(2)

1.2.3.3 紅酵母細(xì)胞生物量的測定 取10mL培養(yǎng)液，9000r/min離心15min;倒掉上清液，用蒸餾水洗滌2～3次;再用蒸餾水將菌體移入預(yù)先干燥至恒重M0的稱量瓶中，置90℃電熱恒溫干燥箱中干燥至恒重，用精密電子天平稱量稱量瓶和菌體總重M，則細(xì)胞生物量公式如式(3):

W(g/L)=1000×(M-M0)/10 式(3)

式中:W-細(xì)胞生物量，g/L;M-稱量瓶和菌體總重，g;M0-稱量瓶凈重，g。

1.2.4 液態(tài)發(fā)酵實驗設(shè)計

1.2.4.1 糖蜜酸處理對色素產(chǎn)量的影響 取三份糖蜜，每份為170g/L，分別用鹽酸、磷酸、硫酸處理，并另再取一份不作處理，作為空白樣。其中酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，MgSO41g/L，K2HPO40.5g/L，初始p H6.0，轉(zhuǎn)速250r/min，接種齡48h，裝液量50mL/250mL，在28℃下按10%接種量發(fā)酵120h后測定類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1.2.4.2 糖蜜添加量對色素產(chǎn)量的影響 選擇糖蜜添加量為 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200g/L，其中酵母粉 10g/L，蛋白胨 10g/L，MgSO41g/L，K2HPO40.5g/L，初始 p H6.0，轉(zhuǎn)速 250r/min，接種齡48h，裝液量50mL/250mL，在28℃下按10%接種量發(fā)酵120h后測定類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1.2.4.3 培養(yǎng)時間對色素的影響 取糖蜜170g/L，發(fā)酵時間分別選擇為 72、96、120、144、168、192、216、240h研究菌體生長變化。其中酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，MgSO41g/L，K2HPO40.5g/L，初始 pH6.0，轉(zhuǎn)速250r/min，接種齡48h，裝液量50mL/250mL，在28℃下按10%接種量發(fā)酵后測定類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

1.2.4.4 破壁方法對色素產(chǎn)量的影響 取糖蜜170g/L，用1.2.3.1中的五種方法破壁。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖蜜酸處理對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖1可知，三個酸處理組的單細(xì)胞色素含量、細(xì)胞生物量、色素產(chǎn)量都高于未酸處理組，處理效果濃硫酸＞磷酸＞鹽酸。原因可能是，糖蜜用濃硫酸處理后，加酸使部分雙糖轉(zhuǎn)化為單糖，可以為微生物所利用。再經(jīng)過煮沸，可殺死營養(yǎng)細(xì)胞，驅(qū)逐揮發(fā)酸等有害氣體。并且，經(jīng)過離心，去掉了大部分雜質(zhì)。因此，廢糖蜜經(jīng)過酸處理更有利于菌體生長和類胡蘿卜素的積累，且硫酸的效果最好。

圖1 酸處理糖蜜對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響Fig.1 Effect of acid-treated molasses on the production of carotenoids by Rhodotorula glutinis

2.2 糖蜜添加量對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

由圖2和圖3可知，用糖蜜代替葡萄糖對紅酵母進(jìn)行發(fā)酵，其色素產(chǎn)量最大值為葡萄糖發(fā)酵的0.97倍，生物量為1.04倍，證明糖蜜可以替代葡萄糖作為紅酵母液態(tài)培養(yǎng)基中的碳源，而用糖蜜做碳源在一定程度上提高了生物量，可能是因為糖蜜中富含的營養(yǎng)物質(zhì)可以提高其生物量。產(chǎn)量幾乎相同時，葡萄糖使用量為40g/L，而糖蜜添加量為170g/L，是葡萄糖的4.25倍。原因為本實驗所用的每1g原甜菜糖蜜含有0.214g總糖，甜菜糖蜜所含糖類幾乎全為蔗糖，而純蔗糖培養(yǎng)紅酵母產(chǎn)量比葡萄糖高，但其價格也高于葡萄糖，如果用糖蜜作碳源即使是在以170g/L添加量的情況下，其成本也較葡糖糖大幅度減少。由此證明甜菜糖蜜可以替代葡萄糖作為紅酵母液態(tài)發(fā)酵的廉價碳源。糖蜜做碳源的培養(yǎng)基色素產(chǎn)量與葡萄糖的相比較低，主要原因可能是，糖蜜做碳源的培養(yǎng)基中的生物量遠(yuǎn)高于葡萄糖的，糖蜜延長了發(fā)酵時間。在發(fā)酵時間(5d)之內(nèi)，僅促進(jìn)了紅酵母的生長，還未來得及進(jìn)行色素積累，此方面還需要進(jìn)一步研究。

從經(jīng)濟角度上看，近幾年糖蜜的價格為800元/t，而葡萄糖漿為4300元/t。從圖4中可以看出，在相同的添加量下，以葡萄糖漿為唯一底物培養(yǎng)基的色素產(chǎn)量為糖蜜的三倍，而價錢卻高了五倍，綜合成本考慮，糖蜜是一種廉價高效的培養(yǎng)基碳源替代物，將進(jìn)一步研究。

2.3 培養(yǎng)時間對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

如圖5所示，在初始階段，細(xì)胞生物量和色素產(chǎn)量都在緩慢增加，到120h后，單細(xì)胞色素含量也在逐漸增加，但細(xì)胞生物量開始下降但隨后又開始增加。到達(dá)168h，單細(xì)胞色素含量和色素產(chǎn)量均為最高值。原因可能是因為糖蜜延長了發(fā)酵時間，產(chǎn)物積累得慢。因此選擇最佳發(fā)酵時間為168h。

圖2 不同糖蜜添加量對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響Fig.2 Effect of different additive molasses on the production of carotenoids by Rhodotorula glutinis

圖3 糖蜜與葡萄糖最大產(chǎn)值時各因素情況Fig.3 Various factors effect of production value maximization of molasses and glucose

圖4 糖蜜與葡萄糖相同添加量時各因素情況Fig.4 Various factors effect of the same addition of molasses and glucose

圖5 培養(yǎng)時間對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the production of carotenoids by Rhodotorula glutinis

2.4 破壁方法對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

從圖6可以看出，在五種破壁方法中，自溶的破壁效果最差，只有少部分類胡蘿卜素被釋放出來。其次是研磨法，研磨法的破壁效果一般，且研磨費時費力，容易造成研磨不充分，而且在轉(zhuǎn)移時不能夠完全轉(zhuǎn)移，會有少量的損失。然后是酸熱法和超聲波破碎法及超聲波輔助酸熱法。其中酸熱法的破壁效果顯著，在某實驗條件下酸熱法具有最好的破壁效果，分析機制可能是由于酸熱法使用了對細(xì)胞壁中原來結(jié)構(gòu)緊密的某些成分具有強力疏松作用的鹽酸，并配合沸水處理及冷卻處理，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)得以破壞，胞內(nèi)物質(zhì)溶出。利用超聲波輔助酸熱法得到的類胡蘿卜素的含量最高，酸熱法次之，兩者結(jié)果差異不顯著(p＞0.05)，考慮到生產(chǎn)成本、工藝操作等因素，酸熱法操作簡單，成本低廉，破壁效果顯著，所以本實驗選擇酸熱法為最佳破壁方法。

圖6 五種破壁方法對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的影響Fig.6 Effect of five cell disruption methods on the production of carotenoids by Rhodotorula glutinis

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素實驗，確定了糖蜜預(yù)處理的最佳酸為硫酸，最佳破壁方法為酸熱破壁法。得出紅酵母(Rhodotorula sp.)AS2.2241，在以糖蜜添加量為170g/L、蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，培養(yǎng)基初始pH為6.0、搖床轉(zhuǎn)速為 250r/min、接種齡 48h，裝液量 100mL/500mL，在28℃下按10%接種量發(fā)酵，發(fā)酵時間為168h的培養(yǎng)條件下，菌株的生物量為30.75g/L，單細(xì)胞色素含量為104μg/g，色素產(chǎn)量為26mg/L。甘蔗糖蜜來源允足、價格低廉，作為原料發(fā)酵生產(chǎn)胡蘿卜素成本較低。紅酵母(Rhodotorula sp.)AS2.2241，發(fā)酵周期短，以蔗糖蜜作為原料，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，菌株的生物量、類胡蘿卜素含量及類胡蘿卜素產(chǎn)量均得到較大提高，具有良好的應(yīng)用前景。另外，類胡蘿卜素為胞內(nèi)脂溶性小分子物質(zhì)，分子量在500左右，其提取方法也可以首先將酵母菌體干燥成粉末，再用有機溶劑浸提。這種方法簡便可靠，有待于進(jìn)行相關(guān)研究。

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