雙酶水解羅非魚碎肉制備肉味香精前體物研究

楊建延，劉海英，過世東

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

目前，羅非魚的加工方式以加工成魚片為主，而剩余的骨架和碎肉等下腳料不能得到有效的利用，造成資源的浪費。本研究利用蛋白酶水解得到蛋白酶解液前體物制取肉味香精［1］。人們利用酶解法制備肉味香精已有不少的報道，酶解法相比傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法具有反應(yīng)溫和、能耗低、可控性強、污染少等優(yōu)點［2］。利用多酶對肉類蛋白進(jìn)行水解具有水解徹底、目標(biāo)產(chǎn)物得率高、能得到氨基酸和小肽含量豐富的水解液［3］，制得的肉味香精擺脫了通過單酶水解制備肉味香精缺乏煲湯燉肉感和原汁原味感的缺陷［4］。本文通過木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，復(fù)合蛋白酶分別與風(fēng)味蛋白酶組合水解羅非魚碎肉來探討組合方式對肉味香精前體物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍羅非魚魚骨架 廣西南寧百洋水產(chǎn)技術(shù)有限公司;中性蛋白酶 5.0×104U/g、木瓜蛋白酶5.0×104U/g 廣西南寧龐博生物技術(shù)有限公司;復(fù)合蛋白酶7.0×104U/g、風(fēng)味蛋白酶5.0×102LAPU/g

無錫雪梅酶制劑科技有限公司，各蛋白酶的作用特性見表1。

DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩床器 江蘇太倉實驗儀器廠;p H計 瑞士梅特勒-托利多公司;DL-5臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;Ag1100安捷倫液相色譜儀 美國安捷倫公司;Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚骨架碎肉制備 將冷凍的羅非魚骨架常溫下解凍，去鰭，去腮，清洗，用刀切成2cm長寬的方塊，瀝干備用。

1.2.2 蛋白酶酶解魚骨架碎肉條件的單因素實驗稱取一定質(zhì)量的蛋白酶，加入一定比例的水溶解，放入恒溫振蕩水浴鍋升溫至設(shè)定溫度，再加入羅非魚魚骨架碎肉，調(diào)節(jié)pH，水解一定的時間，水解過程中間斷的調(diào)節(jié)pH，水解完成后取出放入沸水浴中滅酶10m in。然后4000 r/m in轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液待測。以溫度、酶添加量、pH、水解時間為因素分別對四種蛋白酶進(jìn)行單因素實驗。

表1 各個蛋白酶的特點Table 1 The properties of protease

1.2.3 總氮測定 凱氏定氮法［5］。

1.2.4 氨基氮測定 電位滴定法［6］。

1.2.5 水解度計算方法 水解度的計算:水解度DH(%)=(水解后上清液氨基氮質(zhì)量-水解前上清液氨基氮質(zhì)量)/(樣品中總氮質(zhì)量-水解前上清液氨基氮質(zhì)量)×100。

1.2.6 游離氨基酸測定方法 分析方法:OPAPMOC柱前衍生化。

色譜條件:色譜柱(250×4.6)mm，5μm;柱溫40℃;流動相:A相:稱取8.0g結(jié)晶乙酸鈉于1000m L燒杯中，加入1000m L開水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解，再加225μL三乙胺，攪拌并加5%的醋酸，將pH調(diào)到7.20±0.05，加入5m L四氫呋喃，混合后備用;B相:稱取8.0g結(jié)晶乙酸鈉于800m L燒杯中，加入400m L開水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解，滴加2%的醋酸，將pH調(diào)到7.20±0.05，將此溶液加入800m L乙腈和800m L甲醇備用;流速1.0m L/m in;紫外檢測器338、262nm(Pro，Hypro);梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表2 氨基酸分析梯度洗脫表Table 2 The gradient elution table of amino acid analysis

1.2.7 肽分子量分布測定方法 色譜條件:色譜柱TSKgel2000 SWXL 300mm×7.8mm;流動相:乙腈/水/三氟乙酸(45/55/0.1，V/V/V);檢測 UV220nm;流速0.5m L/m in;柱溫30℃。樣品制備:吸取樣品2m L于10m L容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣。分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品:細(xì)胞色素 C(MW 12500)、抑肽酶(MW 6500)、桿菌酶(MW 1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189);儀器操作方法及計算:操作參照中華人民共和國藥典2000版，第二部附錄VD;數(shù)據(jù)處理及計算由Waters M32 GPC軟件自動進(jìn)行。

表3 組合酶解酶作用條件及其水解度Table 3 Action conditions of double enzymes and their DH(%)

2 結(jié)果與分析

2.1 各蛋白酶作用條件對水解度的影響

從圖1可以得出木瓜蛋白酶的最適作用條件為:酶添加量 1750U/g，水解時間 5h，pH6.5，溫度50℃。從圖2可以得出中性蛋白酶的最適作用條件為:酶添加量 2000U/g，水解時間 3h，pH7.0，溫度50℃。從圖3可以得出復(fù)合蛋白酶的最適作用條件為:酶添加量 1750U/g，水解時間 4h，pH7.5，溫度50℃。從圖4可以得出風(fēng)味蛋白酶的最適作用條件為:酶添加量 20LAPU/g，水解時間 4h，pH 6.5，溫度50℃。

由此可見上述幾種蛋白酶作用條件溫和，溫度在50℃附近，最適作用 pH接近肉的天然 pH(5.5～6.5)。羅非魚蛋白水解液的水解度隨著酶的添加量的增加逐漸趨于飽和，如添加過多則會造成更多的浪費。隨著水解時間的延長，水解度達(dá)到一定值后基本不再變化，主要是由于酶活力隨著時間逐漸下降，且由于產(chǎn)物的累積對反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用［5］，它們都符合典型的酶的作用特點。

2.2 組合酶解對羅非魚水解液品質(zhì)的影響

根據(jù)風(fēng)味蛋白酶和其他蛋白酶的最佳酶解條件，實驗采用表3的酶解條件對羅非魚碎肉進(jìn)行酶解，從而探究組合酶解的效果。其中，酶添加量為各酶的飽和添加量，考慮到風(fēng)味蛋白酶在6.5～7.0水解度相差不大且最高，木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶水解pH取6.5，中性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶水解pH取7.0，復(fù)合蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶水解pH取7.0。溫度都為50℃，料液比 1∶2，水解時間 4h。

2.2.1 組合酶解對游離氨基酸的影響 通過液相色譜對水解液的游離氨基酸進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表4。

由表3可知，木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶組合水解液的水解度偏小于后兩組。從表4可知木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶組合的水解液氨基酸總量，含硫氨基酸，鮮味氨基酸，親水性氨基酸以及疏水性氨基酸都明顯高于其余兩組。

圖1 木瓜蛋白酶的酶添加量、水解時間、pH、溫度對水解度的影響Fig.1 Effect of amount of papain，heating time，pH，temperature on the DH

氨基酸與還原糖的Maillard反應(yīng)在香精中起到了重要的作用，它們對揮發(fā)性物質(zhì)的生成有很大貢獻(xiàn)。各單個的氨基酸與還原糖的反應(yīng)產(chǎn)生不同的氣味。目前檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)包括吡嗪(煮熟的，燒烤的，烘焙谷物的氣味)，烷基吡嗪(堅果的，烤的)，烷基吡啶(青草味的，澀的，苦味的)，吡咯(谷物味)，酰基吡啶(餅干味)，呋喃和呋喃酮(芳香味，燒焦味，辛辣味，焦糖味)，苯酚類(青草味，堅果味，芳香味)，噻吩(肉味)［7］。

圖2 中性蛋白酶的酶添加量、水解時間、pH、溫度對水解度的影響Fig.2 Effect of amount of neutral protease，heating time，pH，temperature on the DH

含硫氨基酸在Maillard反應(yīng)中生成含硫化合物產(chǎn)生肉味，含硫氨基酸包括蛋氨酸和半胱氨酸，在Maillard反應(yīng)過程中半胱氨酸非?；钴S。半胱氨酸在Maillard反應(yīng)過程中通過Strecker降解會形成硫化氫、氨和乙醛，它們又和Maillard反應(yīng)過程中產(chǎn)生的羰基中間產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)，從而形成多種重要的風(fēng)味化合物，如呋喃、吡嗪、吡咯、噻唑以及其它雜環(huán)化合物，對肉味風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)［3］。風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶組合酶解得到的羅非魚蛋白水解液的含硫氨基酸高達(dá)13.06%，是一種很好的制備肉味香精的前體物;鮮味氨基酸在調(diào)味品中起到增強鮮味的作用，它們與核苷酸共同作用構(gòu)成香精的鮮味，它們在Maillard反應(yīng)前后的變化很小，可能因為它們是親水性氨基酸的緣故。曾曉房等［8］發(fā)現(xiàn)在Maillard反應(yīng)前后疏水性游離氨基酸的降解程度明顯高于親水性游離氨基酸。風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶組合酶解得到的羅非魚蛋白水解液的鮮味氨基酸占到總的游離氨基酸的13.08%，疏水性氨基酸占到52.34%。這表明木瓜蛋白酶相較復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶能得到氨基酸的能力更強。綜上所述，利用風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶組合水解得到的蛋白水解液得到更多的含硫氨基酸，鮮味氨基酸以及疏水性氨基酸，所以它是一種更好的肉味香精前體。

2.2.2 組合酶解對分子量分布的影響 通過液相色譜對水解液的分子量分布進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表5。

圖3 復(fù)合蛋白酶的酶添加量、水解時間、pH、溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of amount of protamex，heating time，pH，temperature on the DH

由表5可知，三組水解液的肽分子量分布大體相似，差別不明顯。他們的分子量范圍97%以上的肽段分子量小于1000u，分子量在77%左右的肽段小于500u，分子量小于2000u的占到總體的99.5%左右。

曾曉房［8］通過胰蛋白酶制備的雞骨架蛋白水解液中Mw＜1000u的肽段占總肽的79.45%，Mw＞5000u占8.91%，劉平［9］制備的大豆蛋白水解液中Mw＜1000u的肽段占總肽的78.36%，程林坤［10］制備的牛肉蛋白肽Mw＜1000u的肽段占總肽的67%，Mw＜500u占總肽的26.4%。而通過組合酶解制備的魚肉水解液區(qū)別于很多的畜禽水解液和植物蛋白水解液，可能是跟魚肉本身的蛋白種類和氨基酸組成有關(guān)系。

圖4 風(fēng)味蛋白酶的酶添加量、水解時間、pH溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of amount of flavourzyme，heating time，pH，temperature on the DH

肽廣泛存在于食品中和蛋白酶解物中，而且被認(rèn)為是食品中重要的風(fēng)味增強劑和前體物。已有研究表明多種氨基酸和糖產(chǎn)生的風(fēng)味和肽和糖產(chǎn)生的風(fēng)味不是相似的，在Maillard反應(yīng)中缺乏肽造成的風(fēng)味缺陷是氨基酸所不能彌補的［11］。肽對于Maillard反應(yīng)的機理至今不是很清楚，主要是由于分離技術(shù)的滯后造成的。肽在Maillard反應(yīng)中在還原糖的存在下既存在本身的降解和交聯(lián)，又直接與還原糖發(fā)生反應(yīng)［12］。鏈長不同和結(jié)構(gòu)不同的肽具有不同的滋味，主要包括酸味、甜味、苦味、鮮味、黃油味、牛肉味［11］。由于Stercker反應(yīng)中氨基酸是必不可少的原料，所以肽或蛋白質(zhì)在沒有氨基酸存在的條件下對于Maillard反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)的貢獻(xiàn)很小，有研究表明肽通過形成環(huán)化二肽和吡嗪酮(烤香味，堅果味)這兩種風(fēng)味化合物對風(fēng)味產(chǎn)生影響。原則上肽或蛋白質(zhì)在熱反應(yīng)中會生成少量的氨基酸，但它們的作用微乎其微，另外還原糖的降解產(chǎn)物能與肽賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)，也能與精氨酸與色氨酸的側(cè)鏈反應(yīng)［13］。

Ogasawara［14］發(fā)現(xiàn)分子量介于 1000～5000u 的肽段對湯料的口腔飽滿度、鮮味和持續(xù)性都有增強作用。小肽相對于大分子肽在Maillard反應(yīng)中的活性要活潑很多。在Maillard反應(yīng)中，各肽段的降解率與肽段分子量關(guān)系明顯，肽段的分子量越小，降解率越大，分子量小于1000u的肽段降解率高達(dá)91.66%［15］。劉平［9］研究還原糖對大豆肽的降解和交聯(lián)時發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時間的延長，大豆肽在Maillard反應(yīng)中反應(yīng)程度加劇，糖促進(jìn)了肽在Maillard反應(yīng)中的交聯(lián)與降解，其中 ＞5000u和 ＜1000u肽段在Maillard反應(yīng)中均具有較高的反應(yīng)活性，1000～5000u肽段的反應(yīng)活性較低。所以通過組合酶解得到的水解液含有97%分子量小于1000u的肽段，是一種很好的香精前體物。

表4 組合酶解蛋白水解液的游離氨基酸含量Table 4 Free amino acids contents of hydrolysis acted by double enzymes

表5 組合酶解水解液的分子量分布情況Table 5 Molecular weight distribution of hydrolysis acted by double enzymes

3 結(jié)論

通過木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶組合水解得到的羅非魚碎肉蛋白水解液氨基酸總量，含硫氨基酸，鮮味氨基酸以及疏水性氨基酸都顯著高于中性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶，復(fù)合蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶的組合;通過組合酶解得到的羅非魚碎肉蛋白水解液的肽分子量小于1000u的肽段占到總量的97%以上。綜上所述，利用木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶組合酶解羅非魚碎肉制的水解液有望作為一種很好的肉味香精的前體物。

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