響應(yīng)面法優(yōu)化百香果醋的發(fā)酵條件

霍丹群，蔣 蘭，王 霜，楊 平，3，馬璐璐，徐 勇，3，侯長(zhǎng)軍

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044;2.重慶大學(xué)弘深學(xué)院，重慶400044;3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000)

百香果又稱(chēng)西番蓮、巴西果、雞蛋果，是西番蓮科(Passifloraceae)多年生木質(zhì)藤本植物果實(shí)的通稱(chēng)，因其果汁可散發(fā)出菠蘿、香蕉等多種水果的濃郁香味，故得名百香果。它是世界上已知最香的水果之一，被國(guó)內(nèi)外譽(yù)為“果汁之王”［1-2］。國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)研究表明，百香果還具有抗炎、抗焦慮、降血脂、降血壓等多種保健功能［3-8］。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，果醋越來(lái)越受到人們的關(guān)注。一方面，果醋營(yíng)養(yǎng)豐富，并有很好的食療功效，能夠輔助治療糖尿病和高血壓，還有美容、減肥效果［9-12］;另一方面，果醋釀造技術(shù)的發(fā)展，為緩解鮮果滯銷(xiāo)和果品資源的加工利用提供了一條有效的解決途徑。本研究以重慶區(qū)域種植的百香果為原料，對(duì)果醋釀制工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為百香果醋的釀制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果 市售;安琪葡萄酒用高活性干酵母安琪酵母公司;醋酸菌 實(shí)驗(yàn)室保藏;果膠酶、氫氧化鈉、酵母膏、碳酸鈣、亞硫酸鈉 重慶博藝化學(xué)試劑有限公司。

手持糖度計(jì) 天津鏡象儀器公司;酒精濃度計(jì)河北武強(qiáng)儀表廠;恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);恒溫水浴鍋 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密p H計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 百香果→清洗榨汁→粗濾→澄清→調(diào)糖度→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→過(guò)濾→果醋配制→果醋飲料成品［13］。

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 選果、洗凈 選取新鮮、柔軟適中、基本成熟的果實(shí)，剔除霉?fàn)€、病蟲(chóng)害果子后，用清水清洗3～4次。

1.2.2.2 榨汁、果膠酶處理 將清洗后的百香果榨汁后，加入果膠酶處理。4000活力單位的液體果膠酶用量為0.05%，溫度為40℃左右，處理后所得果汁較澄清透明。

1.2.2.3 調(diào)整糖度 為了使釀成的酒質(zhì)量好，并促使發(fā)酵順利進(jìn)行，澄清后的原汁需根據(jù)果汁成分及成品要求調(diào)整糖度和酸度。

1.2.2.4 菌種活化 酵母菌種子培養(yǎng):將2.5g安琪酵母用含5%的蔗糖溶液50mL活化30min，待有大量小氣泡產(chǎn)生即可;醋酸菌種子培養(yǎng):將凍藏醋酸菌種子接種到含25mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，溫度33℃，150r/min培養(yǎng)24h，作為一級(jí)種子，按5%的體積比將一級(jí)種子接種到種子培養(yǎng)基中，33℃，150r/min培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子。

1.2.2.5 酒精發(fā)酵 將果膠酶處理后的果汁90℃殺菌10min，然后接入一定量的經(jīng)活化的酵母培養(yǎng)液，在密閉容器中進(jìn)行，溫度保持在28～32℃，發(fā)酵時(shí)間4d，當(dāng)酒精含量為6.0%vol以上，轉(zhuǎn)入醋酸發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)經(jīng)常檢查發(fā)酵液的溫度、糖、酸及酒精含量等。

1.2.2.6 醋酸發(fā)酵 接入一定量的醋酸菌于酒精發(fā)酵醪中，發(fā)酵溫度30～33℃。發(fā)酵時(shí)要不時(shí)攪拌或通入空氣，并每天檢查發(fā)酵醪醋酸含量，發(fā)酵時(shí)間為7d。

1.2.2.7 后處理 發(fā)酵完畢的果醋經(jīng)粗濾，在醋液中加入適量的蔗糖等進(jìn)行口味調(diào)和，制成百香果醋。

1.2.3 酒精發(fā)酵工藝條件的確定

1.2.3.1 酒精發(fā)酵工藝條件的單因素確定 250mL錐形瓶按裝瓶量80%裝瓶發(fā)酵，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，對(duì)酒精發(fā)酵的條件進(jìn)行探索:溫度(26、28、30、32、34℃，固定糖度14%，接種量 0.1%)、最初糖度(8%、10%、12%、14%、16%，固定溫度 30℃，接種量0.1%)、接種量 (0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，固定溫度30℃，糖度14%)。

1.2.3.2 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)原理對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程中的溫度、糖度、接種量三個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用4因素3水平L9(34)的正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最后一列作為缺省項(xiàng)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平。

表1 酒精發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for optimizing the alcohol fermentation

1.2.4 醋酸發(fā)酵工藝條件的確定

1.2.4.1 醋酸發(fā)酵工藝條件的單因素確定 因醋酸菌為好氧菌，在250mL錐形瓶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)按裝瓶量30%裝瓶發(fā)酵，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，對(duì)醋酸發(fā)酵的條件進(jìn)行探索:溫度(28、30、32、34、36℃，固定發(fā)酵酒精度6%，接種量11%);初始酒精度(5%、6%、7%、8%、9%，固定溫度30℃，接種量11%);接種量(5%、8%、11%、14%、17%，固定發(fā)酵溫度 30℃，酒精度6%)。

1.2.4.2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行響應(yīng)面分析方法對(duì)醋酸發(fā)酵三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 2 Factors and levels in the central composite design

1.2.5 測(cè)定方法 酒精測(cè)定:酒精計(jì)法;總糖測(cè)定:糖度計(jì)法;總酸測(cè)定［14］:酸堿滴定法，以醋酸計(jì);p H測(cè)定:精密pH計(jì)法;微生物檢測(cè):稀釋平板計(jì)數(shù)法。

2 結(jié)果與討論

2.1 酒精發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.1.1 不同溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度分別是26、28、30、32、34℃，糖度 14%，酵母菌接種量0.1%，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酒精度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different temperature on alcoholic fermentation

從圖1可知，隨著溫度的升高，發(fā)酵后酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為30℃左右時(shí)，酒精度最高。因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，微生物隨著溫度的升高，繁殖速度加快，但是當(dāng)發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí)會(huì)使酵母代謝過(guò)于旺盛，造成酵母提前老化，妨礙色、香、風(fēng)味的形成，還易造成雜菌滋生，不利于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。故選取30℃作為發(fā)酵過(guò)程的最適溫度。

2.1.2 不同糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響 發(fā)酵糖度分別是8%、10%、12%、14%、16%，溫度 30℃，接種量0.1%，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酒精度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

從圖2可知，糖度在8%～14%之間，發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度呈上升趨勢(shì)，隨后呈下降趨勢(shì)。糖度高時(shí)產(chǎn)生的酒精度也相對(duì)較高，但糖度過(guò)高卻會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致酒精度降低，故實(shí)驗(yàn)選取14%作為發(fā)酵初始糖度。

2.1.3 不同接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響 接種量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，發(fā)酵溫度30℃，糖度14%。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酒精度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖2 不同糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different sugar degree on alcoholic fermentation

圖3 不同接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different inoculation on alcoholic fermentation

從圖3可知，酵母接種量過(guò)少，酒精發(fā)酵就會(huì)緩慢，生產(chǎn)周期相應(yīng)延長(zhǎng)。但接種量過(guò)大，發(fā)酵液里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體的繁殖，造成酒精度降低。綜合考慮，選取0.15%作為酒精發(fā)酵的接種量。

2.1.4 酒精發(fā)酵正交優(yōu)化 以單因素實(shí)驗(yàn)中獲得的最適條件為基礎(chǔ)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考察溫度、糖度、接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得結(jié)果如表3。

表3 酒精發(fā)酵L9(34)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for the alcohol fermentation

根據(jù)表3的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由極差值R可以看出影響醋酸發(fā)酵的因素A＞B＞C，即酒精發(fā)酵溫度＞糖度＞接種量。對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4 所示，F(xiàn)A＞ F0.05(2，2)，F(xiàn)B＜F0.05(2，2)，F(xiàn)C＜F0.05(2，2)，說(shuō)明溫度對(duì)酒精發(fā)酵差異顯著，而糖度、接種量差異均不顯著。結(jié)合R值和方差分析結(jié)果綜合考慮，得出以下結(jié)論:優(yōu)化方案為A2B2C2，即發(fā)酵溫度30℃，糖度14%，接種量0.15%，按照最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行發(fā)酵，最后酒精度為6.2%。

表4 酒精發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance in orthogonal experiment of alcohol fermentation

2.2 醋酸發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)酸度發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度分別是28、30、32、34、36℃，發(fā)酵酒精度 6%，接種量 11%，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酸度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different temperature on acetic acid fermentation

從圖4可知，溫度在28～32℃之間，發(fā)酵產(chǎn)生的酸度呈上升趨勢(shì);于32～36℃時(shí)，呈下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度為32℃左右時(shí)，酸度最高。當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，醋酸菌生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酸較低，但是溫度過(guò)高，會(huì)造成菌體老化加快，因此確定醋酸發(fā)酵的最適溫度為32℃。

2.2.2 酒精度對(duì)酸度發(fā)酵的影響 發(fā)酵初始酒精度分別是 5%、6%、7%、8%、9%，溫度 30℃，接種量11%，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酸度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different alcohol degree on acetic acid fermentation

從圖5可知，隨著酒精度的升高，發(fā)酵產(chǎn)生的酸度呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)酒精度數(shù)為6%左右時(shí)，產(chǎn)酸量最大。當(dāng)酒精度繼續(xù)升高時(shí)，醋酸產(chǎn)量反而降低，因?yàn)樵诎l(fā)酵初期，過(guò)高的酒精度，滲透壓較高，這樣會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng)代謝，造成產(chǎn)酸下降。故確定醋酸發(fā)酵的最適酒精度為6%。

2.2.3 接種量對(duì)酸度發(fā)酵的影響 發(fā)酵接種量分別是5%、8%、11%、14%、17%，發(fā)酵溫度30℃，酒精度6%，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酸度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of different inoculation on acetic acid fermentation

從圖6可知，當(dāng)接種量為11%左右時(shí)，酸度最高。接種量大時(shí)菌體濃度高，發(fā)酵速率較快，但當(dāng)接種量超過(guò)一定范圍時(shí)，發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被在醋酸菌消耗，造成產(chǎn)酸量降低。綜合考慮，選取11%作為醋酸發(fā)酵過(guò)程所需的接種量。

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 醋酸發(fā)酵的響應(yīng)面分析依據(jù)Box-Bebnken中心法則設(shè)計(jì)了15組實(shí)驗(yàn)，包括3組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

利用Design Expert軟件對(duì)表5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得酸度(Y)對(duì)自變量溫度(x1)、酒精度(x2)、接種量(x3)的多元回歸方程:

表5 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Box-Behnken Experiments design and the results of these experiments

對(duì)得出的回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表6所示。由表6可知:模型p＜0.01(p＜0.0001)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性。失擬項(xiàng)p＞0.05(p=0.1808)，失擬項(xiàng)不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.9951，表明酸度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)果醋工藝。在總的作用因素中差異極顯著差異顯著，x3、x1x3差異不顯著。因此，可以用此模型對(duì)果醋工藝進(jìn)行分析研究。

表6 方差分析表Table 6 Variance analysis

2.2.4.2 響應(yīng)面分析 利用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖如圖7～圖9所示，發(fā)酵溫度、初始酒精度、接種量及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可以從圖中直觀地反映出來(lái)，并確定各個(gè)因素的最佳水平。等高線(xiàn)形狀可以反映交互作用大小，當(dāng)為橢圓形時(shí)，表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著。圖7中，接種量固定在零水平時(shí)，酸度隨著溫度和酒精度的升高而增加，達(dá)到最大值后開(kāi)始降低，其等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明兩者交互作用顯著。圖8中，酒精度固定在零水平時(shí)，酸度隨著溫度和接種量的升高而增加，達(dá)到最大值后呈下降趨勢(shì)，從等高線(xiàn)可知溫度與接種量的交互作用不顯著。圖9中，溫度固定在零水平時(shí)，酸度隨著酒精度和接種量的升高而增加，之后呈下降趨勢(shì)，坡度較緩，從等高線(xiàn)可知其交互作用為顯著。

2.2.4.3 最佳條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)該回歸方程求解優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為:溫度32.74℃，酒精度5.78%、接種量10.97%，此條件下酸度可達(dá)4.55%。由于要考慮實(shí)際生產(chǎn)，選擇優(yōu)化后條件為:溫度32.5℃，酒精度6%、接種量11%。并且在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酸度達(dá)到4.54%。因此采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)較可靠。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.3.1 感官指標(biāo) 色澤呈淡黃色;酸味柔和，具有百香果特有的香味;基本澄清，有微量沉淀。

2.3.2 理化指標(biāo) 總酸(以醋酸計(jì))≥4g/100mL，總糖含量≥1g/100mL。

2.3.3 微生物指標(biāo) 根據(jù)《中華人民共和國(guó)釀造食醋的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》，微生物指標(biāo)應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)食醋衛(wèi)生國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》，大腸菌群≤3個(gè)/100mL，致病菌(腸道菌)未檢出。

圖7 溫度和酒精度交互影響酸度的曲面圖Fig.7 Response surface showing the interactive effects of temperature and alcohol degree on acetic acid fermentation

圖8 溫度和接種量交互影響酸度的曲面圖Fig.8 Response surface showing the interactive effects of temperature and inoculation on acetic acid fermentation

圖9 酒精度和接種量交互影響酸度的曲面圖Fig.9 Response surface showing the interactive effects of alcohol degree and inoculation on acetic acid fermentation

3 結(jié)論

本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了百香果醋釀造過(guò)程中酒精發(fā)酵的最佳工藝參數(shù):發(fā)酵溫度30℃，糖度14%，接種量0.15%，發(fā)酵后的酒精度可達(dá)6.2%。在酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法建立了醋酸發(fā)酵中發(fā)酵溫度、初始酒精度、接種量對(duì)百香果醋含量間的回歸模型，模型的決定系數(shù)R2=0.9951，表明該模型擬合程度較好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)果醋工藝。醋酸發(fā)酵的最佳工藝參數(shù):溫度32.5℃，酒精度6%、接種量11%，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵果醋酸度達(dá)到4.54%。

利用百香果釀制的果醋香味濃郁，含有豐富的維生素及各種人體需要的物質(zhì)，隨著人們生活水平的提高，市場(chǎng)對(duì)于果醋的需求量越來(lái)越大，百香果果醋將具有很好的開(kāi)發(fā)前景。

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