草魚鹽溶蛋白乳化性的研究

楊玉玲，彭曉蓓，董 哲，2，游 遠(yuǎn)，徐紅萍

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003;2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085)

鹽溶蛋白是動(dòng)物肌肉中的主要蛋白質(zhì)，在肉制品加工過程中承擔(dān)著乳化、膠凝、溶解、吸水、吸油等多種功能，在很大程度上決定著肉制品的質(zhì)量。糜類肉制品如火腿腸、哈爾濱紅腸、漢堡、肉圓等都是乳狀液類型產(chǎn)品，在這些制品中，蛋白質(zhì)的乳化作用決定著產(chǎn)品的均勻性、水油滲出率、產(chǎn)品穩(wěn)定性等。郭延娜等［1］研究了豬肉高鹽溶蛋白-肌原纖維蛋白質(zhì)的乳化性;楊萬根等［2］研究了淘汰蛋鴨鹽溶蛋白的乳化性和起泡性。大豆蛋白是肉制品中常見的配料之一，關(guān)于其乳化性的研究報(bào)道已有很多［3-5］。蛋白質(zhì)的乳化性主要受蛋白質(zhì)的來源、氨基酸組成等因素影響［6］，同時(shí)也受加工條件包括離子強(qiáng)度、p H、油的種類和添加量、壓力、添加物(磷酸鹽、非肉類蛋白)等多種因素的影響［7-8］。Richard 等［9］報(bào)道在制備肉糜時(shí)添加5%的NaCl可增加肌肉勻漿的乳化性和乳化穩(wěn)定性。劉永等［10］報(bào)道了蛋清蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性在pH8.0時(shí)達(dá)到最大。魚類是我國(guó)居民膳食中重要的動(dòng)物蛋白來源。近年來，我國(guó)對(duì)魚類蛋白溶解性、凝膠特性進(jìn)行了部分研究，草魚是我國(guó)魚類中最常見的品種，每年產(chǎn)量在220萬噸以上，居我國(guó)魚類養(yǎng)殖品種的首位，是制備魚肉產(chǎn)品(魚丸、魚糕、魚香腸、魚卷、模擬蝦肉、模擬蟹肉等)的優(yōu)良原料。董哲等［11-12］曾研究了草魚鹽溶蛋白的溶解性和凝膠特性，但目前還沒有關(guān)于魚類蛋白乳化性的研究報(bào)道。本文研究了草魚鹽溶蛋白的組成、乳化能力和乳化穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活草魚 市售;一級(jí)大豆油 上海嘉里糧油;次高級(jí)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(肌球蛋白重鏈200ku、鈣調(diào)速結(jié)合蛋白130ku、兔磷酸化酶B 97.4ku、牛血清蛋白66200u、肌動(dòng)蛋白43000u)Sigma公司。

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型;GL-20B型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;722N可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草魚肉中鹽溶蛋白的提取工藝 活草魚宰殺后，取魚背肉經(jīng)洗液分散后提取鹽溶蛋白，具體步驟按本實(shí)驗(yàn)室前期采用的方法進(jìn)行［11］。

1.2.2 魚鹽溶蛋白組成的測(cè)定 采用SDS-PAGE法測(cè)定草魚鹽溶蛋白的組分，濃縮膠濃度為4%(w/w)，分離膠濃度為10%(w/w)。電泳條件為:濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，考馬斯亮藍(lán)染色1h，脫色液脫色［13］。

1.2.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

1.2.3.1 乳化活性的測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將鹽溶蛋白沉淀溶于不同的緩沖液中，使蛋白濃度為1%。添加所需體積的蛋白溶液和食用油使油和蛋白溶液總體積為20mL。用高速組織搗碎機(jī)10000r/min均質(zhì)90s后，立即從底部吸取50μL乳濁液，加入0.1%(w/w)的SDS溶液5mL，混勻，在500nm下測(cè)定吸光值［9］。 乳 化 活 性 指 數(shù) (Emulsifying Activity Index，EAI)的計(jì)算公式為:

其中，dil=100，稀釋因子;A=A500，吸光度;C=0.001(g/mL)，蛋白濃度;∮=分散相體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3.2 乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsifying stability index，ESI)的測(cè)定 將1.3.3.1中經(jīng)均質(zhì)得到的剩余乳濁液靜置60min后，第二次從底部吸取50μL，用0.1%SDS溶液稀釋100倍，混勻后在500nm測(cè)定吸光度。乳化穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算公式為:

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在 p H(4、5、6、7、8)、離子強(qiáng)度(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8)、油水體積比(V油∶V水，1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8)單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)三者進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表見表1。

表1 乳化活性和乳化穩(wěn)定性響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors and levels for EAI and ESI with response surface method

2 結(jié)果與討論

2.1 草魚鹽溶蛋白的組成

從草魚鹽溶蛋白的電泳圖(圖1)中可見，SSP中含有四條深色帶和一條淺色帶;通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)比，得出SSP中四個(gè)主要組分的分子質(zhì)量分別為200、40、30、23ku，一個(gè)次要組分為 90ku。根據(jù)動(dòng)物鹽溶蛋白組成的理論和標(biāo)準(zhǔn)蛋白組分可以判斷出200ku是肌球蛋白重鏈;40ku是肌動(dòng)蛋白;30ku和23ku是兩條肌球蛋白輕鏈。陸海霞等［14］報(bào)道了秘魯魷魚肌球蛋白重鏈的分子質(zhì)量為200ku，肌動(dòng)蛋白的分子質(zhì)量為43ku，說明魷魚與草魚的肌球蛋白重鏈具有相同的分子質(zhì)量，而肌動(dòng)蛋白分子質(zhì)量存在差異。

圖1 SSP的SDS-PAGE圖譜Fig.1 Paragraph of SSP by SDS-PAGE

2.2 各因素對(duì)鹽溶蛋白乳化性的影響

2.2.1 p H對(duì)鹽溶蛋白乳化性的影響 圖2為在離子強(qiáng)度0.5、水油體積比1∶5條件下的p H與SSP乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的關(guān)系曲線。在pH4～5范圍內(nèi)，草魚鹽溶蛋白(等電點(diǎn)為4.6)的EAI值變化不大，在p H5處達(dá)到最小值后隨p H增加逐漸增加，到p H8時(shí)EAI值達(dá)到最大值，為13.14m2/g;ESI在p H4開始隨pH增加而逐漸增大，到p H6時(shí)達(dá)到最大值，為0.5137，而后逐漸下降。

圖2 pH對(duì)EAI和ESI的影響Fig.2 Effect of pH on EAI and ESI

張濤等［15］報(bào)道了鷹嘴豆分離蛋白EAI在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最小值，而ESI在等電點(diǎn)附近時(shí)出現(xiàn)最大值;而張根生等［16］報(bào)道了大豆分離蛋白的EAI和ESI均在等電點(diǎn)附近時(shí)出現(xiàn)最小值。說明草魚SSP的EAI隨pH變化趨勢(shì)與前兩種蛋白質(zhì)的EAI變化趨勢(shì)一致，在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最小值。這三種蛋白質(zhì)共同的特點(diǎn)是在等電點(diǎn)處溶解度最低。但草魚ESI在pH為6時(shí)達(dá)到最大值，比較前兩種蛋白質(zhì)的ESI變化情況，可以得出蛋白質(zhì)的ESI變化規(guī)律主要受蛋白質(zhì)來源控制，與等電點(diǎn)關(guān)系比較復(fù)雜。

2.2.2 離子強(qiáng)度對(duì)鹽溶蛋白乳化性的影響 圖3為在p H6、水油體積比1∶5條件下的離子強(qiáng)度與SSP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的關(guān)系曲線。圖3表明，鹽溶蛋白的EAI值在離子強(qiáng)度0.4～0.5之間變化不大，從0.5開始逐漸增加，到0.6時(shí)達(dá)到最大值11.60m2/g，而后逐漸下降。ESI值在離子強(qiáng)度0.4處為最大值0.83，之后隨著離子強(qiáng)度的增加而逐漸下降，到0.7時(shí)ESI又呈上升趨勢(shì)。

圖3 離子強(qiáng)度對(duì)EAI和ESI的影響Fig.3 Effect of ionic strength on EAIand ESI

Mu等［6］報(bào)道了紅薯蛋白離子強(qiáng)度對(duì)EAI值和ESI值的影響與pH有關(guān)，在pH＜4時(shí)，紅薯蛋白在離子強(qiáng)度為1.0的NaCl溶液中的EAI值比離子強(qiáng)度為0的溶液中的EAI值高，而當(dāng)pH＞4時(shí)，后者的EAI值高于前者;在pH為4.0時(shí)，離子強(qiáng)度0.1的紅薯蛋白ESI值等于離子強(qiáng)度為0時(shí)的ESI值。在其他pH下，離子強(qiáng)度0.1的紅薯蛋白ESI值基本上低于離子強(qiáng)度為0時(shí)的ESI值。Zhang等［17］報(bào)道了鷹嘴豆分離蛋白的EAI在離子強(qiáng)度為0.1時(shí)為最小值，而后在0.1～1.0范圍內(nèi)隨離子強(qiáng)度增加而增加。由此可見，離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)EAI和ESI的影響不僅受其自身大小的影響，還與實(shí)驗(yàn)時(shí)的pH有很大關(guān)系，并且因蛋白質(zhì)來源不同而不同。

2.2.3 油水體積比對(duì)鹽溶蛋白乳化性的影響 圖4為在pH6、離子強(qiáng)度0.6時(shí)，水油體積比與SSP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的關(guān)系曲線。圖4顯示，油水體積比為1∶4時(shí)，鹽溶蛋白的EAI值最小，而后隨著油水體積比的增加EAI值逐漸增加。這可能是因?yàn)楦哂拖囿w積比降低了SSP的表面張力，阻止了脂肪球的聚集，從而提高了乳化液的穩(wěn)定性［18］，而蛋白質(zhì)乳化活性的提高和降低油水界面張力的能力與它們的表面疏水性存在一定的正相關(guān)［19］。ESI值在油水體積比為1∶5時(shí)達(dá)到最大值。

圖4 油水體積比對(duì)EAI和ESI的影響Fig.4 Effect of the ratio of oil to water volume on EAIand ESI

2.2.4 各因素對(duì)乳化性的綜合影響 按表1設(shè)計(jì)研究各因素對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表2。

對(duì)表2中的EAI結(jié)果進(jìn)行方差分析和回歸分析得表3和以下方程:

EAI=22.24+4.44A+2.97B+1.55C-0.012AB+2.05AC+2.92BC。其中，R2=0.9473;CV(%)=6.24。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果Table 2 Results of response surfacemethod

從表3可見，pH和離子強(qiáng)度是影響EAI指標(biāo)的極顯著因素，而油水體積比為非顯著因素。

方程的R2和CV(%)值表明方程擬合較好，實(shí)驗(yàn)操作可信。對(duì)方程求偏導(dǎo)獲得EAI的最大值為46.39m2/g。此時(shí)各因素的條件為:pH7.94，離子強(qiáng)度0.71，油水體積比1∶6.93。并對(duì)其做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮實(shí)際因素選取條件pH7.94，離子強(qiáng)度0.7，油水體積比1∶7做三組平行實(shí)驗(yàn)的平均值，得出EAI值為45.78m2/g，接近預(yù)測(cè)值。

表3 EAI的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Square analysis of EAI

對(duì)表2中的ESI結(jié)果進(jìn)行方差分析和回歸分析時(shí)得表4和以下方程:

ESI=0.74+0.065A-0.054B+0.016C+0.012AB-0.017AC+0.065BC-0.14A2-0.066B2-0.024C2。其中，R2=0.9254，CV(%)=2.24。

由表4可見，一次項(xiàng)的三因素中pH是影響ESI值的顯著因素，二次項(xiàng)中僅pH為極顯著因素。

對(duì)方程求偏導(dǎo)，得出ESI最大值為0.812。此時(shí)各因素的條件為pH為7.32，離子強(qiáng)度0.58，油水體積比1∶5.17。此時(shí)以各因素的條件:pH7.32，離子強(qiáng)度0.58，油水體積比1∶5做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，三次取平均值得ESI值，為0.784m2/g比預(yù)測(cè)值略低，但高于響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中20個(gè)實(shí)驗(yàn)值。

表4 ESI響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果Table 4 Square analysis of response surface method for ESI

鑒于p H顯著影響EAI和ESI;離子強(qiáng)度極顯著影響EAI，因此做pH和離子強(qiáng)度對(duì)SSP乳化性影響的三維圖，結(jié)果見圖5。由圖可見，EAI值隨pH和離子強(qiáng)度增加而顯著增加;SEI值先隨pH和離子強(qiáng)度增加而增加，在pH7.5，離子強(qiáng)度0.6時(shí)達(dá)最大值，而后隨pH和離子強(qiáng)度增加而降低。

圖5 pH和離子強(qiáng)度對(duì)SSP的乳化性影響模型Fig.5 Effect of pH and ionic strength on EAI of SSP

對(duì)乳狀液而言，既要有良好的乳化能力EA1，又要有良好的乳化穩(wěn)定性ESI。因此，同時(shí)考慮p H和離子強(qiáng)度對(duì)鹽溶蛋白乳化能力和乳化穩(wěn)定性時(shí)，二者的最佳條件為pH 7.5、離子強(qiáng)度0.6。由于油水體積比對(duì)EA1和ESI均不顯著，考慮原料價(jià)格因素，取EA1取得最大值時(shí)的1∶7作為最佳值。在此條件下，EAI值為28.4m2/g，ESI值為 0.74。

3 結(jié)論

SSP中肌球蛋白的重鏈、兩條輕鏈和肌動(dòng)蛋白的分子質(zhì)量分別為200、30、23、40ku。pH 和離子強(qiáng)度是影響SSP乳化能力的極顯著因素;但僅p H是影響乳化穩(wěn)定性的顯著因素。SSP乳化活性指數(shù)的最大值為45.78m2/g;乳化穩(wěn)定指數(shù)的最大值為0.812。綜合分析乳化特性指標(biāo)，草魚鹽溶蛋白乳化性的最佳條件為:p H7.5，離子強(qiáng)度0.6，油水相體積比為1∶7。

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