DHA油脂在精煉過程中氧化穩(wěn)定性的變化

龔東平，韓小軍，陳國平，刑光才，王 平，王 飛

(江蘇中邦制藥有限公司，江蘇南京211300)

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)，俗稱腦黃金，屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，對人體具有多種優(yōu)越的生理功效［1-2］。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，DHA油脂因其高不飽和度，極易氧化產(chǎn)生異腥味，影響味覺和營養(yǎng)［3］。裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)的DHA油脂需依次經(jīng)歷脫膠、堿煉、脫色、脫臭等工序除雜后，才可得到感官品質(zhì)滿足消費(fèi)者需求的DHA精油。DHA油脂精煉的每個(gè)環(huán)節(jié)所經(jīng)歷的物化條件各異，去除的微組分也各有不同。這些微組分或可充當(dāng)油脂的抗氧化劑(如酚類物質(zhì))，或可充當(dāng)油脂的促氧化劑(如脂質(zhì)氫過氧化物)［4-5］，因此油脂的氧化穩(wěn)定性在整個(gè)精煉過程中呈動態(tài)變化。關(guān)于微生物DHA油脂在精煉過程中微組分和氧化穩(wěn)定性的變化目前尚無研究報(bào)道。本文將分析裂殖壺菌DHA油脂在精煉過程中磷脂、色素、總酚、FFA、金屬離子、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的變化情況，并采用DPPH法分析DHA油脂中微組分清除自由基的能力，最后以光照法和Rancimat法比較精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂的氧化穩(wěn)定性，旨在為DHA油脂的科學(xué)精煉提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂殖壺菌DHA油脂(包括毛油、脫膠油、堿煉油、脫色油、精油) 取自某公司精制車間的同一批次油料。

紫外-可見分光光度計(jì) 美國Perkin Elmer公司;GZX-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;Rancimat-743油脂氧化穩(wěn)定儀 瑞士Metrohm公司。

1.2 精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂微組分變化的測定

精煉各環(huán)節(jié)的DHA油脂，按照GB5537-1985測定磷脂含量;按照J(rèn)Y/T 015-1996測定鐵和銅含量;按照GB/T 5009.37-2003，測定過氧化值(POV)表征一級氧化產(chǎn)物的含量，測定酸價(jià)(AV)表征游離脂肪酸(FFA)的含量;采用三氯乙酸萃取法［6］測定其硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)表征二級氧化產(chǎn)物的含量，結(jié)果以丙二醛(MDA)計(jì);采用甲醇萃取油脂中的酚類物質(zhì)并通過福林酚比色法［7-8］測定DHA油脂中總酚的含量，結(jié)果以沒食子酸(GAE)計(jì);將DHA油脂溶于正己烷后，采用全波長掃描法［7-8］通過吸光值表征色素的含量;DHA油脂甲酯化后，采用GC分析其脂肪酸組成［9］。

表1 微組分在DHA油脂精煉過程中的變化Table 1 Change of minor compounds in DHA oil during the refining process

1.3 DHA油脂甲醇萃取物清除DPPH·能力

采用甲醇萃取精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂中的微組分后［7-8］，按如下方法評價(jià)其自由基清除能力［7-8］:取1.5mL甲醇萃取物與1.5mL DPPH試劑(0.15mmol/L，甲醇溶解)混勻后，常溫反應(yīng)30min，以甲醇作空白，于517nm處測定其吸光值，記為 OD1;同理，測定1.5mL甲醇與1.5mL DPPH試劑混合液的吸光值OD0。DPPH清除率按如下公式計(jì)算:

DPPH·清除率(%)=［(OD0-OD1)/OD0］×100

1.4 精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂的氧化穩(wěn)定性

光照加速氧化［8，10］:取精煉各環(huán)節(jié)的 DHA 油脂各40.0g于100mL具塞三角瓶中，置入同一密閉紙箱(42cm長×32cm寬×32cm高)中，樣品上方分別均勻懸掛兩只45W三基色白織燈。紙箱密封后置入通風(fēng)室內(nèi)，箱內(nèi)溫度維持在(27±1)℃，定時(shí)取樣測定油樣的POV。

Rancimat法加速氧化［10］:準(zhǔn)確稱取精煉各環(huán)節(jié)的DHA油脂3.00g置于樣品管中，于測定溫度80℃、空氣流速9L/h的條件下測定DHA油脂氧化所需的誘導(dǎo)時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 DHA油脂在精煉過程中的組成變化

油脂中的微組分種類眾多且含量較低，本實(shí)驗(yàn)選擇性地分析了DHA油脂中較為常規(guī)的微組分在精煉過程中的含量變化，結(jié)果如表1所示。

2.1.1 磷脂在DHA油脂精煉過程中的變化 磷脂的存在會影響油脂的感官品質(zhì)和氧化穩(wěn)定性，是一類兼有抗氧化性質(zhì)和促氧化性質(zhì)的物質(zhì)。在有金屬離子存在的情況下，由于磷脂中磷酸基團(tuán)螯合金屬離子的作用，磷脂可以發(fā)揮抗氧化功效;但在高濃度下，由于磷酸基團(tuán)的極性，易于富集在油脂表面并降低表面張力，從而吸收油樣表面的氧氣加速脂質(zhì)氧化［4］。裂殖壺菌DHA油脂中的磷脂在整個(gè)精煉過程中不斷減少，到精油時(shí)僅存 0.36ppm，去除率達(dá)99.9%以上，其中脫膠、堿煉、脫色環(huán)節(jié)分別除去了48.8%、39.8%、11.2%(表 1)。

2.1.2 金屬離子在DHA油脂精煉過程中的變化鐵、銅等金屬離子可以降低油脂自動氧化誘發(fā)期的反應(yīng)活化能，并且可以促進(jìn)脂質(zhì)過氧化合物(ROOH)分解產(chǎn)生脂質(zhì)自由基(ROO·、RO·)，從而加速脂質(zhì)氧化［4］。分析發(fā)現(xiàn)鐵離子在DHA毛油中的含量為3.70ppm(表1)，脫膠后其含量降至0.40ppm(降低89.2%)，分析原因可能是與磷脂結(jié)合的鐵離子在脫膠環(huán)節(jié)中隨膠質(zhì)被一并去除。脫色后，DHA油脂中的鐵離子降至0.10ppm。銅離子含量在脫色環(huán)節(jié)以前并無明顯變化，保持在0.70ppm左右，脫色后大幅降至0.13ppm。因此可見，在脫色環(huán)節(jié)中，活性炭等吸附劑可以有效地去除油脂中的金屬離子。

2.1.3 FFA在DHA油脂精煉過程中的變化 FFA會使油脂帶有刺激性氣味而影響油脂的風(fēng)味和食用價(jià)值。當(dāng)油脂中FFA含量達(dá)到一定值時(shí)，由于其羧基具有極性，易于富集在油脂的表面并吸收氧氣從而加速脂質(zhì)氧化［4，11］，因此在油脂精煉過程中要盡量除掉FFA。本研究將DHA油脂中FFA的含量以酸價(jià)(AV)間接表示，從表1可知，脫膠油的AV高于毛油(p＜0.05)，這可能是油脂在酸性脫膠條件下發(fā)生了輕微水解，或是少量磷酸基團(tuán)殘留。堿煉環(huán)節(jié)去除部分FFA后AV下降(p＜0.05)，但在后續(xù)脫色環(huán)節(jié)中，由于脫色劑中的酸堿催化劑及油脂中水份的存在，DHA油脂可能發(fā)生了輕微水解，從而使脫色油的酸價(jià)又有回升(p＜0.05)。脫臭環(huán)節(jié)FFA可以被餾出，DHA油脂 AV降為(0.11±0.01)mg/g，同Jung［12］和 Farhoosh［13］等報(bào)道一樣，脫臭環(huán)節(jié)并不能除盡油脂中的FFA或其他酸性小分子。

2.1.4 氧化產(chǎn)物在DHA油脂精煉過程中的變化脂質(zhì)自動氧化的一級氧化產(chǎn)物(ROOH)會裂解成脂質(zhì)自由基，進(jìn)而促進(jìn)未氧化油脂發(fā)生鏈?zhǔn)窖趸?ROOH繼續(xù)氧化分解產(chǎn)生的醛、酮、酸等小分子，嚴(yán)重地影響油脂的感官品質(zhì)和氧化穩(wěn)定性［4］。分析發(fā)現(xiàn)，裂殖壺菌DHA油脂的POV和TBARS值在整個(gè)精煉過程中的變化趨勢一致(表1):自毛油到堿煉油，氧化產(chǎn)物不斷增加，原因在于脫膠及堿煉環(huán)節(jié)系常壓加熱(70～80℃)操作，在促氧化因素(如空氣、金屬離子、FFA、熱量等)的作用下，油脂發(fā)生氧化;后續(xù)脫色及脫臭環(huán)節(jié)系高溫(＞150℃)真空操作，一級氧化產(chǎn)物ROOH不斷分解，二級氧化產(chǎn)物在真空條件不斷逸出，使得DHA精油的POV最終降為0。

2.1.5 色素在DHA油脂精煉過程中的變化 油脂中類胡蘿卜素的主要吸收波長在430～460nm之間，葉綠素及其衍生物的吸收波長在550～710nm之間［8］。類胡蘿卜素因具有淬滅單線態(tài)氧分子的作用，可以阻止脂質(zhì)的光氧化;在低氧分壓下(＜150mm Hg)，類胡蘿卜素的共軛雙鍵還可以與脂質(zhì)過氧自由基(ROO·)形成一種穩(wěn)定共振的類胡蘿卜素自由基從而起到抗氧化作用;與之相反，葉綠素及其衍生物常作為光敏物質(zhì)，促進(jìn)脂質(zhì)發(fā)生光氧化［4-5］。全波長掃描發(fā)現(xiàn)，裂殖壺菌DHA油脂在波長430～460nm之間有很強(qiáng)的吸光值(圖1)，說明類胡蘿卜素為其主要色素，這與Aki等［14］報(bào)道裂殖壺菌富含類胡蘿卜素的結(jié)論相符合。分析得出，DHA油脂中的色素主要在脫臭環(huán)節(jié)以熱脫色的方式去除，脫色環(huán)節(jié)效果并不佳。以DHA油脂在450nm處的吸光值為例(表1)，從毛油到脫色油，OD450維持在2.56～2.88之間，脫臭后OD450由2.56大幅降至0.12。

圖1 DHA油脂-正己烷(1∶6，V/V)混合液的全波長掃描圖Fig.1 Visible spectra of DHA oil-hexane(1∶6，V/V)

2.1.6 酚類物質(zhì)在DHA油脂精煉過程中的變化油脂中的酚類物質(zhì)不僅影響油脂的感官品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值，而且有些酚類物質(zhì)可以向脂質(zhì)自由基提供自由氫，或者與之結(jié)合，從而阻斷自由基與未氧化的脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使自動氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)終止;有些酚類物質(zhì)還具有螯合金屬子的性質(zhì)從而起到抗氧化作用［4-5］。從表1可知，裂殖壺菌DHA油脂含有酚類物質(zhì)，且毛油中含量最高，達(dá)到(16.59±0.82)μg GAE/g，但是隨著精煉環(huán)節(jié)的進(jìn)行，其含量不斷降低，到精油時(shí)含量已降至(4.32±0.33)μg GAE/g，整個(gè)精煉過程降低了74%。

2.1.7 脂肪酸組成在DHA油脂精煉過程中的變化

油脂的脂肪酸組成及其不飽和度是影響其氧化穩(wěn)定性的內(nèi)在因素。裂殖壺菌產(chǎn)DHA油脂在整個(gè)精煉過程中的脂肪酸組成變化如表2所示。

表2 DHA油脂在精煉過程中脂肪酸組成的變化(面積歸一法)(%)Table 2 Change of fatty acid composition(Area percent)during the refining process(%)

分析發(fā)現(xiàn)，DHA油脂的脂肪酸組成在整個(gè)精煉過程中并無顯著變化，DHA含量維持在42%左右，多不飽和脂肪酸總含量維持在68%左右。裂殖壺菌DHA油脂的這種高不飽和度是其易遭受氧化的根本原因。

2.2 DHA油脂甲醇萃取物清除DPPH·的能力

DPPH·是一種在517nm處有特征吸收的穩(wěn)定自由基，當(dāng)具有自由基清除能力的抗氧化劑與之反應(yīng)時(shí)，其特征吸收值降低，因此可以用來評價(jià)抗氧化劑的活性［15］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌DHA油脂的甲醇萃取物具有清除DPPH·能力，說明其中含有內(nèi)源性的抗氧化劑。從圖2可知，DHA油脂的甲醇萃取物清除DPPH·的能力:精油＞脫色油＞脫膠油＞毛油＞堿煉油(p＜0.05)，這一規(guī)律與甲醇萃取物中酚類物質(zhì)的含量并不呈正相關(guān)(酚類含量:精油＜脫色油＜堿煉油＜脫膠油＜毛油，p＜0.05)，原因可能是:a.毛油、脫膠油、堿煉油中的雜質(zhì)過多，影響了酚類等活性物質(zhì)清除自由基的效果;b.DHA油脂中的部分微組分在后續(xù)的脫色及脫臭環(huán)節(jié)中生成了其他具有清除DPPH·能力的化合物。

圖2 DHA油脂甲醇萃取物清除DPPH·的能力Fig.2 DPPH radical-scavenging activity of methanol extracts from DHA oils

2.3 精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂對光穩(wěn)定性比較

對DHA油脂進(jìn)行光照加速氧化實(shí)驗(yàn)是為了考察其光氧化穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)以POV為評價(jià)指標(biāo)，考察精煉各環(huán)節(jié)的DHA油脂對光穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn)(圖3):堿煉油＜毛油/脫膠油＜脫色油＜精油(p＜0.05)。結(jié)合表1從圖中可知，DHA油脂的對光穩(wěn)定性與其初始的氧化產(chǎn)物含量呈正相關(guān)(氧化產(chǎn)物含量:堿煉油 ＞脫膠油 ＞毛油 ＞脫色油 ＞精油，p＜0.05)，毛油、脫膠油、堿煉油等雖含有較多的類胡蘿卜素，但其脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量偏高，促氧化因素的作用強(qiáng)于抗氧化因素，因而油脂對光穩(wěn)定性相對較弱。另外，這三種油脂中還含有其他含量相對較多的微組分(如金屬離子、FFA、光敏物質(zhì)、磷脂等)，它們同樣對脂質(zhì)具有促氧化作用［4-5］。

2.4 精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂對熱穩(wěn)定性比較(Rancimat法)

精煉各環(huán)節(jié)的DHA油脂氧化產(chǎn)物含量相差較大，特別是毛油、脫膠油、堿煉油的POV偏高，采用Schaal烘箱法不能客觀地評價(jià)這五種油脂的氧化穩(wěn)定性強(qiáng)弱［10］。因此本實(shí)驗(yàn)還采用Rancimat法來比較精煉各環(huán)節(jié)DHA油脂的相對氧化穩(wěn)定性。Rancimat法評價(jià)油脂氧化穩(wěn)定性的原理:油脂氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性小分子(如醛、酮、酸等)導(dǎo)入蒸餾水中，記錄電導(dǎo)率的變化情況，根據(jù)二階求導(dǎo)計(jì)算出誘導(dǎo)時(shí)間(電導(dǎo)率變化最快的時(shí)間點(diǎn))，誘導(dǎo)時(shí)間越長表明氧化穩(wěn)定性越強(qiáng)［10］。

圖3 DHA油脂對光穩(wěn)定性比較Fig.3 Comparison of oxidative stability of DHA oils under light

從圖4可知，氧化穩(wěn)定性(誘導(dǎo)時(shí)間):堿煉油(0.57h)＜毛油(0.74h)＜脫膠油(1.18h)＜精油(1.47h)＜脫色油(2.44h)，結(jié)合表1分析得出:a.DHA毛油中類胡蘿卜素、酚類物質(zhì)等雖然含量最高，但金屬離子、磷脂等促氧化組分含量也相對較高，所以其氧化穩(wěn)定性并非最高;b.脫膠油比毛油氧化穩(wěn)定性高，或歸因于脫膠環(huán)節(jié)中去除了大量的金屬離子和磷脂;c.堿煉油最不穩(wěn)定，是因?yàn)橹|(zhì)氧化產(chǎn)物含量最高，且水化后的磷脂、皂角、水分等極性雜質(zhì)不利于其氧化穩(wěn)定性;d.脫色油、精油的穩(wěn)定性高于其他三種油脂，在于上述的促氧化組分在高溫脫色及脫臭環(huán)節(jié)中得以大量去除;e.高溫脫臭環(huán)節(jié)雖然進(jìn)一步地降低了促氧化組分的含量，但因類胡蘿卜素和酚類物質(zhì)等抗氧化組分大量損失，從而導(dǎo)致精油的氧化穩(wěn)定性相對降低。

圖4 DHA油脂對熱穩(wěn)定性的比較Fig.4 Comparison of thermal stability of DHA oils by the Rancimat method

3 結(jié)論

3.1 精煉各環(huán)節(jié)的DHA油脂在脂肪酸組成上無明顯差異，但微組分含量各異，且整體呈下降趨勢，從而導(dǎo)致各環(huán)節(jié)DHA油脂的氧化穩(wěn)定性有所差異。DHA油脂對光穩(wěn)定性:精油＞脫色油＞毛油/脫膠＞堿煉油;DHA油脂對熱穩(wěn)定性(Rancimat法):脫色油＞精油＞脫膠油＞毛油＞堿煉油。與報(bào)道的植物油脂不同，裂殖壺菌DHA毛油并非最穩(wěn)定，這與其高不飽和度以及內(nèi)源性微組分有關(guān)。毛油、脫膠油、堿煉油雖然在酚類物質(zhì)、類胡蘿卜素含量上遠(yuǎn)高于脫色油和精油，但是因?yàn)楹休^高的促氧化微組分(如磷脂、FFA、皂角等)，特別是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和金屬離子，從而使其氧化穩(wěn)定性低于后兩者。DHA油脂甲醇萃取物清除DPPH的效果也間接支持了這一結(jié)論。

3.2 脫膠及堿煉環(huán)節(jié)系常壓加熱操作，由于空氣的介入，加之油脂中含有較多的促氧化組分，導(dǎo)致DHA油脂在這兩環(huán)節(jié)會發(fā)生氧化。鑒于DHA油脂的高不飽和度和高附價(jià)值，這兩環(huán)節(jié)可在充氮條件下進(jìn)行。后續(xù)的脫色和脫臭環(huán)節(jié)，改善了DHA油脂的品質(zhì)并提高了氧化穩(wěn)定性，但若片面尋求感官品質(zhì)，導(dǎo)致精煉過度，使大量具有抗氧化活性的微組分被去除，會降低DHA精油的氧化穩(wěn)定性［5］，因此脫色和脫臭是優(yōu)化DHA油脂氧化穩(wěn)定性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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