七葉鬼燈檠揮發(fā)油及不同提取物抑菌活性的研究

王 健，黃 慧，王喆之，張 媛，*

(1.藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710062;2.安康學院農學與生命科學院，陜西安康725000)

七葉鬼燈檠(Rodgersia aesculifoliaBatalin)為虎耳草科(Saxifragaceae)鬼燈檠屬多年生草本植物，以根狀莖入藥，稱作索骨丹［1］。七葉鬼燈檠藥用歷史悠久，作為我國傳統(tǒng)的民間草藥用于治療跌打損傷、月經不調和風濕性關節(jié)炎等癥［2-3］。目前國內外有關七葉鬼燈檠的研究主要集中在資源調查、化學成分分析及藥理藥效等方面。對于七葉鬼燈檠抑菌活性的研究，許多學者已經開展了一些有益的工作。七葉鬼燈檠的酸水解提取液對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、福氏痢疾桿菌均有抑制作用，而醋酸乙酯、丙酮提取液則對肺炎克雷伯氏菌和胸膜肺炎桿菌等有一定的抑制作用［4］。胡振英等［5］研究了七葉鬼燈檠不同溶劑提取物對畜禽常見病原菌的抑制作用，結果表明丙酮和乙酸乙酯提取物的抑菌效果最顯著。蔡正軍等［6］對七葉鬼燈檠乙醇提取物及其五個萃取部位進行抑菌研究，發(fā)現乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部位對受試菌均有較強的抑菌活性，在受試菌中對綠膿桿菌的抑制活性最強。韓建華等［7］研究發(fā)現七葉鬼燈檠對小麥赤霉病菌、玉米大斑病菌和辣椒疫霉病菌均有較強的抑菌活性，對菌絲生長的抑制率分別為68.31%、100%、88.76%，對受試菌孢子萌發(fā)抑制作用均達100%。由于同一植物不同提取部位對病菌的抑制程度不同，同一植物相同溶劑的提取物對不同的病原菌的抑制能力也有差異［8-9］，七葉鬼燈檠不同提取物的抑菌活性值得深入研究。為了更好的利用秦巴山區(qū)豐富的七葉鬼燈檠資源，本文采用濾紙片法和牛津杯法評價了七葉鬼燈檠根狀莖的揮發(fā)油及其不同提取物對8種常見菌的體外抑菌活性，以期為開發(fā)新型植物源抑菌劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七葉鬼燈檠于2008年10月初采自陜西戶縣，經陜西師范大學生命科學學院田先華教授鑒定為虎耳草科鬼燈檠屬植物七葉鬼燈檠(Rodgersia aesculifoliaBatalin)。 白 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、解脂假絲酵母(Candidalipolytica)、粘 紅 酵 母 (Rhodotorula glatinis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 西安微生物所;肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 北京微生物所;二甲基亞砜、無水硫酸鈉、甲醇、丙酮、乙酸乙酯 均為國產分析純;鹽酸四環(huán)素、制霉菌素 Wolsen公司;其他試劑均為國產分析純。

TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;BS-1EA振蕩培養(yǎng)箱 國華電器有限公司;FZ102微型植物粉碎機 黃驊市中興有限責任公司;Q/BKYY31-2000型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;SL202N型藥物電子天平 上海明橋精密科學儀器有限公司;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;RII旋轉蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 揮發(fā)油的提?。?0］:將新鮮的七葉鬼燈檠根狀莖自然陰干，粉碎，稱取250g放入共水蒸餾裝置中進行提取，提取時間6h，收集的揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

不同溶劑提取物的制備［11］:采用索氏提取的方法，用石油醚對七葉鬼燈檠根狀莖粉末脫脂至無色，然后依次用乙酸乙酯、丙酮和甲醇分別索氏提取8h，將相應的提取物旋轉蒸發(fā)回收溶劑，濃縮液用干燥箱烘干(45～50℃)，分別得七葉鬼燈檠根狀莖的乙酸乙酯、丙酮和甲醇提取物。

1.2.2 七葉鬼燈檠根狀莖揮發(fā)油及不同溶劑提取物的抑菌活性檢測

1.2.2.1 培養(yǎng)基的制備 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(適用于細菌):精確稱取蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂 15～20g，配制 1000mL 培養(yǎng)基，調節(jié) pH7.0～7.2，微波加熱使充分溶解混勻，分裝，121℃滅菌20min。

豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基(適用于酵母):稱取新鮮豆芽100g，放入燒杯中，加蒸餾水煮沸約30min，用紗布過濾，然后定容至1000mL，再加入蔗糖50g，瓊脂15～20g，煮沸熔化，分裝，121℃滅菌 20min。

1.2.2.2 菌懸液的制備 菌種活化:取實驗菌種在相應培養(yǎng)基斜面上活化。其中細菌在37℃培養(yǎng)24h(肺炎克雷伯氏菌30℃)，酵母菌在28℃培養(yǎng)48h。

菌懸液的制備:在無菌條件下，取活化的菌種用適量無菌生理鹽水(0.9%)稀釋，使菌懸液濃度為106～108CFU/mL。

1.2.2.3 樣品溶液的制備 分別將甲醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物用二甲基亞砜配制成150mg/mL的溶液，同時配制濃度為0.5mg/mL鹽酸四環(huán)素和制霉菌素的二甲基亞砜溶液作陽性對照。上述樣品溶液皆用0.45μm濾膜過濾除菌。

1.2.2.4 七葉鬼燈檠根狀莖揮發(fā)油的抑菌活性檢測方法 采用濾紙片法［12］。將各菌種接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(酵母接種于豆芽汁培養(yǎng)基)，培養(yǎng)18～24h后，制備成濃度為106～107cfu/mL的菌懸液。取0.1mL菌液均勻涂布于平板上，取已滅菌的直徑為6mm濾紙片，浸于15μL的揮發(fā)油(已用0.45μm濾膜過濾除菌)，貼于平板上，以鹽酸四環(huán)素(細菌)和制霉菌素(酵母)作為陽性對照。4℃放置2h后，于37℃恒溫培養(yǎng)24h(酵母在28℃恒溫培養(yǎng)48h)。測其抑菌圈直徑。實驗重復3次。

1.2.2.5 七葉鬼燈檠根狀莖不同溶劑提取物的抑菌活性檢測方法 采用牛津杯法［12］。涂平板后，等距離放入3個滅菌的牛津杯(規(guī)格10mm×7.8mm×6mm)，逐一加入各樣液50μL，分別以DMSO或PBS為陰性對照，以鹽酸四環(huán)素(細菌)和制霉菌素(酵母)作為陽性對照。4℃放置2h后，細菌37℃恒溫培養(yǎng)24h(酵母28℃恒溫培養(yǎng)48h)。測量抑菌圈直徑。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 七葉鬼燈檠根狀莖揮發(fā)油的抑菌活性分析

如表1所示，七葉鬼燈檠根狀莖揮發(fā)油對表皮葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、白色葡萄球菌、釀酒酵母、粘紅酵母和解脂假絲酵母具有不同強度的抑制作用。其中，對肺炎克雷伯氏菌抑制作用最強，抑菌圈直徑達到(29.11±0.31)mm，其次為巨大芽孢桿菌，抑菌圈直徑為(26.77±0.35)mm，抑菌活性均與陽性對照鹽酸四環(huán)素相當(p＞0.05)。揮發(fā)油對表皮葡萄球菌的抑菌效果(抑菌圈直徑為(22.67±0.61)mm)顯著強于陽性對照鹽酸四環(huán)素(p＜0.05)。七葉鬼燈檠根狀莖揮發(fā)油對受試的3種酵母也有一定的抑制作用，其中對粘紅酵母的抑菌作用最強，抑菌圈直徑達到(26.20±0.24)mm，與陽性對照鹽酸四環(huán)素相當(p＞0.05)。

2.2 七葉鬼燈檠根狀莖不同提取物的抑菌活性分析

如表2所示，七葉鬼燈檠根狀莖的甲醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物對表皮葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、白色葡萄球菌、粘紅酵母、解脂假絲酵母具有不同強度的抑菌活性，而對釀酒酵母均未表現出抑制作用。其中，丙酮提取物的抑菌效果最強，對供試菌種(釀酒酵母除外)均有明顯的抑菌效果，對解脂假絲酵母的抑菌活性最強，抑菌圈直徑達到(25.10±0.52)mm，比陽性對照制霉菌素(抑菌圈直徑為(23.82±0.09)mm)的抑菌效果更為顯著(p＜0.05)。另外，對常見的呼吸道感染菌表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的抑制效果也顯著強于陽性對照(p＜0.05)，其抑菌圈直徑分別達到(21.81±0.35)mm和(24.52±0.62)mm。甲醇提取物的抑菌效果相對丙酮提取物較弱，對解脂假絲酵母和表皮葡萄球菌的抑制作用較為明顯，抑菌圈直徑分別為(21.57±0.37)mm和(19.62±0.53)mm，與陽性對照相當(p＞0.05)。乙酸乙酯提取物的抑菌活性相對最弱，對供試菌種的抑菌活性普遍低于陽性對照(p＜0.05)，僅對肺炎克雷伯氏菌的抑菌作用相當于陽性對照鹽酸四環(huán)素(p＞0.05)。

表1 七葉鬼燈檠根狀莖揮發(fā)油的抑菌圈直徑(n=3)Table 1 Diameter of inhibition zone of R.aesculifolia essential oil(n=3)

3 討論

本實驗對七葉鬼燈檠根狀莖的揮發(fā)油及其不同溶劑提取物的抑菌活性進行了初步研究。結果表明，七葉鬼燈檠根狀莖的揮發(fā)油對供試的8種菌均有較強抑菌活性，尤其對表皮葡萄球菌的抑制作用顯著強于陽性對照。據報道鬼燈檠揮發(fā)油的化學成分較為復雜，包括多種脂肪酸類化合物、烷烴類化合物、萜類化合物、胺類化合物、醛酮類化合物，以及少量的芳香族化合物和氧化物［13］，其抑菌活性物質的分離鑒定以及抑菌機理還有待于進一步研究。另外，七葉鬼燈檠丙酮提取物和甲醇提取物均表現出較強的抑菌活性，其中丙酮提取物對常見的呼吸道感染菌表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有極強的抑制作用，抑菌效果優(yōu)于陽性對照。由于七葉鬼燈檠丙酮提取物及其甲醇提取物的抑菌譜較廣，抑菌作用強，可初步推測中等極性的丙酮提取部位和較大極性的甲醇提取部位為七葉鬼燈檠抑菌作用的主要活性部位。研究表明鬼燈檠屬植物的根狀莖中含有巖白菜素、7-甲氧基巖白菜素、鬼燈檠酯、麥角甾醇、紫丁香酸、沒食子酸、熊果苷、谷甾醇、芳樟醇和槲皮素等化學物質［14-16］。其主要成分巖白菜素具有抗炎、抗?jié)儭⒆o肝、抗凝血、止咳等功效［17］。因此，我們推測巖白菜素為七葉鬼燈檠根狀莖提取物的主要抑菌成分，但其抑菌活性還有待進一步的研究證實。

表2 七葉鬼燈檠根狀莖不同提取物的抑菌圈直徑(mm，n=3)Table 2 Diameter of inhibition zone of different extracts from R.aesculifolia(mm，n=3)

4 結論

七葉鬼燈檠根狀莖的揮發(fā)油及提取物含有天然抑菌活性物質，具有光譜的抑菌效果，值得進一步開發(fā)利用。本研究為新型植物源抑菌藥物的篩選、抑菌譜測定和提取過程的追蹤提供了可供參考的數據資料，為深入研究七葉鬼燈檠的抑菌活性物質、進一步開發(fā)利用該資源提供了理論依據。

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