花椒籽中黑色素提取工藝的優(yōu)化研究

徐文秀，王曉燕，王 鵬

(運城學院生命科學系，山西運城044000)

花椒(ZanthoxylumL bungeanum Maxim)別名又叫香椒、大花青椒、山椒，屬被子植物門(Magnoliophydta)雙子葉植物綱(Magnoliopsida)，無患子目(Sapindales)蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)山花椒種(Zanthoxylum schinifolium)。花椒在我國有非常悠久的栽培歷史，是我國傳統(tǒng)的“八大調(diào)味料”之一?；ń吩谖覈饕a(chǎn)區(qū)為陜西(韓城)、四川、重慶、山東、山西、河南、河北等地［1］。據(jù)報道，2009年全國花椒栽培面積已達133.3萬hm2，年產(chǎn)花椒100萬t，花椒籽作為主要副產(chǎn)物，理論上比果皮超出20%左右，因此花椒籽年產(chǎn)約60萬t［2］。山西運城巿有很多丘陵地區(qū)，這些地區(qū)很適合花椒種植。每年大量花椒上巿后，作為副產(chǎn)物的花椒籽，卻長期以來未被充分利用。大量的花椒籽被廉價收購，或當作燃料燒掉或撒入田中作為肥料，甚至被當作廢物丟棄，造成極大的資源浪費。如何利用花椒籽這一資源已迫在眉睫。綜合開發(fā)利用花椒籽既可以解決資源浪費、環(huán)境污染的問題，還可以帶動大批的當?shù)亟忿r(nóng)致富。因此，加快花椒籽的研究開發(fā)具有現(xiàn)實和長遠意義。研究結果［3］表明:花椒籽的種皮富含天然黑色素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，天然黑色素具有抗癌、抑制艾滋病毒復制、抗蛇毒、治療帕金森癥等功能［4］。因此，黑色素在化妝品、食品、醫(yī)藥等領域有著非常廣泛的應用前景。目前，已從黑木耳［5］、黑芝麻［6］、桂花種子皮［7］、黑糯米［8］等天然黑色素食品中提取出黑色素，但有關花椒籽中黑色素提取和開發(fā)利用的研究報道還很少。因此，本實驗研究花椒籽中黑色素提取工藝，為花椒籽黑色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒籽 產(chǎn)自山西運城夏縣;氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇 均為分析純。

AF1104型電子天平 上海越平科學儀器有限公司;101A-1E型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海實驗儀器總廠;752N紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗工藝流程

原料→預處理→按比例加入提取劑→水浴浸提→過濾→定容→比色

1.3 實驗設計

首先確定提取花椒籽黑色素最佳提取溶劑、提取液最大吸收波長。然后通過單因素實驗研究提取液濃度、提取溫度、提取時間、料液比及提取次數(shù)對黑色素提取效果的影響。在單因素實驗的基礎上選取對花椒籽黑色素得率影響明顯的因素:A提取溫度(℃)、B提取時間(min)、C料液比(g/m L)，根據(jù)Box-Behnken中心設計原理，采用Design Expert軟件程序設計3因素3水平的中心組合實驗。因素水平見表1。

表1 旋轉二次正交因素與水平Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 結果與分析

2.1 最佳提取溶劑的確定

在提取溫度 20℃、提取時間 48h、料液比1∶10(g/m L)、提取次數(shù)1次的條件下，用不同的提取溶劑對花椒籽黑色素進行提取。提取結果如表2所示。確定0.1mol/L NaOH溶液為提取花椒籽黑色素的溶劑。

表2 提取溶劑對黑色素得率的影響Table 2 Effect of extraction solvent on extraction ofmelanin

2.2 最大吸收波長確定

在料液比1∶10(g/m L)、提取溫度20℃、提取時間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溶劑NaOH溶液濃度與最大吸收波長的關系。從圖1可以看出:不同濃度提取液，最大吸收波長基本一致。隨著波長的增大，吸光度出現(xiàn)了2個高峰，第1個峰值出現(xiàn)在波長250nm處;第2個峰值出現(xiàn)在波長550nm處。進一步細化研究條件，得出當波長為212nm、540nm時，吸光度出現(xiàn)高峰。212nm處吸光值不穩(wěn)，且其吸光值比540nm處值小，結合相關資料［9］，本實驗選540 nm作為最大吸收波長。

圖1 花椒籽黑色素溶液吸收光譜Fig.1 The absorb curve of themelanin

2.3 單因素實驗結果與分析

2.3.1 提取溶劑濃度對花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶10(g/m L)、提取溫度20℃、提取時間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溶劑NaOH溶液濃度與吸光度的關系。由圖2可以看出，隨著NaOH溶液濃度的增加，提取液吸光度先是不斷升高。當NaOH溶液濃度達到0.35mol/L時，吸光值達到最高，隨后吸光值會逐漸下降。這是因為NaOH溶液濃度升高有助于花椒籽黑色素的提取，但當NaOH濃度過高時，可能會提取出更多雜質(zhì)，黑色素也可能與其它物質(zhì)反應，使其結構受到破壞。從而導致吸光值降低［10］。

圖2 不同濃度對黑色素得率的影響Fig.2 Effect of different concentration on the extraction rate ofmelanin

2.3.2 提取溫度對花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶10(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取時間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溫度與吸光度的關系。由圖3可以看出，提取溫度對花椒籽黑色素得率有一定的影響，隨著溫度的升高，花椒籽黑色素得率增加，在65℃達到最大值，但當溫度超過65℃時，隨著溫度的升高，黑色素得率呈下降趨勢，這是因為:植物黑色素是一類由酚類單體組成的大分子物質(zhì)，具有還原性，易氧化，前人研究表明，在氧化過程中，酚羥基轉變?yōu)轷?0℃及以下溫度對總酚含量的影響無顯著差異，但在60℃以后，酚類物質(zhì)就會發(fā)生變化［11］，即黑色素結構被破壞。

圖3 不同溫度對黑色素得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on the extraction rate ofmelanin

2.3.3 提取時間對花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶10(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取溫度65℃、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取時間與吸光度的關系。由圖4可以看出，在一定的時間范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，花椒籽黑色素得率呈上升趨勢，在4.5h達到最大值，之后呈下降趨勢，這也可能是由于提取時間過長導致黑色素的分解［6］。而且，隨著提取時間的延長會帶來其他雜質(zhì)，會增加后續(xù)精制處理的步驟。

圖4 不同時間對黑色素得率的影響Fig.4 Effect of different time on the extraction rate ofmelanin

2.3.4 料液比對花籽中黑色素得率的影響 在0.35mol/L NaOH溶液、提取溫度 65℃、提取時間4.5h、提取次數(shù)1次的條件下，研究料液比與吸光度的關系。由圖5可以看出，在一定的料液比范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，花椒籽黑色素的得率呈上升趨勢，這是因為加水量越大則提取出來的黑色素就越容易溶解，損失就越少，在1∶30時達到最高點，隨后隨著液體比例的繼續(xù)增加，花椒籽黑色素得率不再增加，稍呈下降趨勢，這是可能因為隨著液體比例的增加，會帶入雜質(zhì)。

圖5 不同料液比對黑色素得率的影響Fig.5 Effect of different solid to liquid ratio on the extraction rate ofmelanin

2.3.5 提取次數(shù)對花椒籽中黑色素得率的影響 在料液比1∶30(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取溫度65℃、提取時間4.5h的條件下，研究提取次數(shù)與吸光度的關系。理論上，黑色素得率應該隨著提取次數(shù)的增加而變大，提取次數(shù)越多，提取越充分，直到得率趨于平衡。但實驗結果證明:在實驗條件下，提取次數(shù)增加，得率變化不大。一次提取吸光值為0.3957，二次提取吸光值為0.4007，三次提取吸光值為0.4008。說明一次提取近乎完全，再增加提取次數(shù)浪費原料、溶劑和勞動力。因此，綜合考慮，提取次數(shù)確定為1次為宜。

2.4 響應面分析結果與優(yōu)化

以提取溫度A、提取時間B、料液比C為自變量，以花椒籽黑色素提取液吸光度為響應值(Y)，進行響應面分析實驗。實驗方案及結果見表3。

表3實驗結果經(jīng)Design Expert軟件程序進行多項式擬合回歸，建立多元二次響應面回歸模型:

各因素的方差分析見表4。

表3 Box-Behnken實驗設計表及結果Table 3 The design and results of Box-Behnken experiments

表4 二次響應面回歸模型方差分析Table4 ANOVA for response surface quadratics model analysis of variance table

表5 變異系數(shù)分析Table 5 Analysis of CV.%

由表4可以看出:模型“Prob＞F”值小于0.01，表明模型是極顯著，在統(tǒng)計學上是有意義的;其中A、C、B2、C2對黑色素提取率影響都極顯著(p＜0.01)，B、A2、AC 的p值(0.01＜p＜0.05)，表明這些因素對黑色素提取率影響顯著。影響花椒籽黑色素提取率的各因素按影響大小排序依次為溫度(A)＞料液比(C)＞時間(B)。模型中失擬項p＞0.05，不顯著，說明所選模型適宜。同時，由軟件分析得到的模型的相關系數(shù) R2為94.63%，變異系數(shù)(C.V%)值為3.29%，說明模型方程能夠很好地反映真實的實驗值，可以利用該回歸方程確定最佳條件。

為進一步直觀說明提取溫度、提取時間和料液比之間的交互作用和對提取液吸光度的影響，通過Design-Expert軟件繪制響應面曲線圖，進行可視化的分析。從3個三維響應面圖(圖6～圖8)可以直觀地觀察到每個自變量對響應值的影響。

圖6 時間與溫度對黑色素得率的響應曲面Fig.6 Curved surface of time and temperature to extraction of melanin

圖7 料液比與溫度對黑色素得率的響應曲面Fig.7 Curved surface of temperature and solid to liquid ratio to extraction of melanin

圖8 料液比與時間對黑色素得率的響應曲面Fig.8 Curved surface of time and solid to liquid ratio to extraction of melanin

由圖6～圖7可知:隨著溫度的增加，黑色素得率也增加，當溫度達到66.32℃時，黑色素得率達到最高，隨后會減小。這可能與過高溫度會破壞黑色素結構有關。由圖6和圖8顯示:隨著時間的延長，黑色素得率先增加，當時間超過4.46h，黑色素得率會減小，這可能是黑色素長時間接觸堿液會分解，從而導致吸光度降低。圖7～圖8表明:隨著料液比增加，黑色素得率會下降，這可能與增加提取溶劑，增加了雜質(zhì)的溶出量有關。

通過回歸模型預測花椒籽黑色素提取的最佳工藝為:提取時間為4.46h、提取溫度為66.32℃、料液比為1∶32.94(g/mL)。在該條件下得到最大的吸光值為0.3083?？紤]到實際操作的可行性，將理論值修正為:提取時間為 4.5h、提取溫度為 66℃、料液比為1∶33(g/mL)，采用此工藝條件進行驗證實驗，實際測得提取液吸光度為0.305，與理論值相差不大，說明采用響應面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實際價值。

3 結論

3.1 比較分析了三個因素對提取花椒籽中黑色素提取率的影響大小，依次為溫度＞料液比＞時間。

3.2 花椒籽黑色素提取的最佳工藝，即提取時間為4.5h、提取溫度為66℃、料液比為1∶33(g/mL)。在該條件下花椒籽黑色素提取液吸光度值為0.305。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1997:20-52.

［2］張玉靜，鄭旭煦，殷鐘意.花椒籽油的開發(fā)利用研究進展［J］.中國油脂，2011，36(7):8-11.

［3］李孟樓，莊世宏.花椒種籽油的脫色方法研究［J］.西北植物學報，2002，22(6):1460-1464.

［4］張名位，孫玲，池建偉，等.黑米、黑大豆、黑芝麻中天然色素性質(zhì)的比較研究［J］.中國糧油學報，1998，13(2):6-9.

［5］張蓮姬，張敬愛.黑木耳中黑色素的提取及其穩(wěn)定性研究［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報，2006，37(3):369-371.

［6］徐利萍，王興國，金青哲，等.黑芝麻中黑色素提取條件的研究［J］.中國油脂，2006，31(4):56-58.

［7］史玉敏，陳洪國，嚴恒.桂花果皮黑色素提取工藝條件研究［J］.中國園藝文摘，2011，6:21-23，146.

［8］楊萍，李琳.黑糯玉米黑色素的提取工藝的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40(6):97-100.

［9］屈清慧，錢春梅，方宇.正交法篩選黑米糠中黑色素的提取工藝［J］.西安醫(yī)科大學學報，2000，21(4):20-21.

［10］陳松，韋萬興，劉志平.從藜豆中提取天然黑色素的工藝研究［J］.應用化工，2011，40(11):1915-1917

［11］李軍，張喬會，藍晶晶.響應面法對山杏核殼黑色素提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(2):295-299.