響應面法優(yōu)化微波輔助提取芋頭多糖工藝研究

姜紹通，汪洪普，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學農產品加工研究院，合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽合肥230009)

芋頭別名為芋魁、土芝，俗稱芋艿，屬天南星科［1］。芋頭中含有豐富的淀粉、膳食纖維、多糖、維生素和礦物質元素，不僅可食用，還具有寬腸胃、補脾胃、腹中癖塊、消癆散結等作用，主治腫毒、牛皮癬、燙火傷等癥［2］。早期研究報道認為其主要功效與其含有花青甙、甾醇和過氧化氫酶等活性成分有關，特別是其中豐富的多糖可能具有重要作用，已有報道芋頭中含有水溶性多糖，且富含雜聚糖，但關于芋頭多糖的提取沒有更為詳盡的資料［3］。多糖是自然界中儲量豐富的生物聚合物，具有能量儲存、結構支持、防御作用和抗原決定性等多方面的生物功能。而植物多糖具有特殊的生物活性，如協(xié)助消化、抗疲勞、抗病毒、抗菌消炎、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、降血糖、降血脂及免疫調節(jié)等。有關研究報道芋頭多糖無毒安全，具有清除自由基、抗腫瘤、增強免疫力等生理功能［4-8］。而關于芋頭多糖提取的方法局限于傳統(tǒng)的水提法，該法提取時間長，提取率低［9］。微波技術是近幾年來用于天然植物有效成分提取的一項新技術，與傳統(tǒng)的萃取方法如水法提取、回流提取、有機溶劑萃取等方法比較，微波萃取技術具有快速、高效、安全、有效成分提取率高、節(jié)能等特點［10-13］。本論文引入微波技術輔助水浴法提取芋頭多糖，并對此方法芋頭多糖的提取工藝進行優(yōu)化研究，旨在為進一步開發(fā)利用芋頭資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芋頭 購于家樂福;苯酚、濃硫酸、無水乙醇、95%乙醇、無水乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

NJL07-3型實驗用微波爐 南京杰全儀器有限公司;UV-2102PC型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;R-201旋轉蒸發(fā)器 上海申勝生物技術有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海培因實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芋頭多糖微波提取工藝 原料預處理:新鮮芋頭→清洗、去皮、切塊→65℃烘干至恒重→粉碎過40目篩→芋頭干粉，待用。

工藝流程:稱取定量芋頭粉末→微波輔助熱水浴浸提→提取液離心(6000r/min，20min)→濾渣→二次提取→合并濾液→酶解去淀粉(先按照20U/g加入液化酶，75℃，pH6.0酶解1.5h，I2/KI檢至無淀粉后再按照200U/g加入糖化酶，60℃，pH6.5酶解1.5h)→95%的乙醇沉淀→無水乙醇淋洗→沉淀復溶→透析(分子量3500，透析36h)→真空濃縮→粗多糖濃縮液→稀釋測多糖。

1.2.2 芋頭多糖的測定 多糖的測定采用苯酚-硫酸法［14］。取2mL提取液，分別加入1mL的6%的苯酚和5mL的濃硫酸，沸水浴5min后立即冷卻，在波長495nm下測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，依葡萄糖標準曲線的回歸方程Y=13.0643X+0.0065(R2=0.9997)計算芋頭粗多糖的含量。

1.2.3 芋頭多糖提取率的測定 芋頭多糖的提取率(%)=芋頭多糖質量/芋頭干粉質量×100

1.2.4 微波輔助提取芋頭多糖單因素實驗 準確稱取 5g 芋頭干粉，在不同的液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)，不同的微波功率(200、300、400、500、600、700W)，不同的微波處理時間(40、60、80、100、120s)，不同的水提溫度(50、60、70、80、90℃)，不同的水提時間(1、2、3、4、5、6h)，不同的提取次數(shù)(1、2、3、4次)等條件下考察各個因素對芋頭多糖提取率的影響。所有實驗均為一式3份，取平均值。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，選擇較佳的液料比和提取次數(shù)。采用Box-Behnken中心組合實驗設計對影響芋頭多糖得率的四個主要因素微波功率、微波處理時間、水提溫度和水提時間進行優(yōu)化［15-16］。實驗因素與水平設計見表1。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Variables and levels in Box-Benhnken experimental design

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 利用Design-Expert 8.05軟件進行實驗設計和分析。實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 液料比對多糖提取率的影響

不同液料比對多糖提取率的影響結果見圖1。

圖1 液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of water/material ratio on polysaccharides yield

由圖1可知，多糖的提取率隨著液料比的增加不斷增加，當料液比為30∶1時開始增加緩慢，因為適當?shù)囊毫媳瓤梢蕴岣叨嗵堑娜艹雎剩毫媳冗^小，溶劑量少導致物料的黏度大，多糖的擴展速度慢會阻止多糖的有效溶出，提取不完全，故提取率較低［17］，而當液料比超過30∶1時，幾乎所有的多糖已經全部溶出，再增加溶劑的量多糖的溶出率增加不明顯，故液料比以30∶1為宜。

2.2 微波功率對多糖提取率的影響

不同的微波功率對多糖提取率的影響結果見圖2。

圖2 微波功率對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharides yield

由圖2可知，當微波功率為400W時，多糖提取率達到最高，再隨著功率的增加，提取率顯著下降。故微波功率選擇400W為宜。因為功率太小，不足以提供足夠的摩擦熱使胞內水分汽化而實現(xiàn)微波破壁，故提取率較低，而微波功率較高，細胞內部溫度上升較快，故破壁作用較大，有利于多糖的溶出［17］，但是功率過高，瞬間的升溫會造成部分多糖降解，導致提取率下降。

2.3 微波處理時間對多糖提取率的影響

不同的微波處理時間對多糖提取率的影響結果見圖3。

由圖3可知，隨著微波處理時間的增加，多糖提取率先增加后減少，當微波處理時間為80s時提取率最高，之后多糖提取率開始下降。因為微波加熱時升溫迅速，處理時間長時會因部分多糖分解而造成損失［18］，故微波處理時間以80s為宜。

圖3 微波處理時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of microwave treatment time on polysaccharides yield

2.4 水提溫度對多糖提取率的影響

不同的水提溫度對多糖提取率的影響結果見圖4。

圖4 水提溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of water extraction temperature on polysaccharides yield

由圖4可知，隨著水提溫度的升高，多糖的提取率增加明顯，當溫度達到80℃時多糖提取率達到最高，而后隨著溫度的繼續(xù)升高多糖提取率又呈現(xiàn)降低趨勢，可能是因為長時間的高溫使得部分多糖降解而導致提取率降低，因此水提溫度以80℃為宜。

2.5 水提時間對多糖提取率的影響

不同的水提時間對多糖提取率的影響結果見圖5。

圖5 水提時間對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of water extraction time on polysaccharides yield

由圖5可知，隨著水提時間的增加，芋頭多糖的提取率逐漸增加且3h后趨于平穩(wěn)，當水提時間為3h時芋頭多糖的得率增加平緩，考慮到提取效率，選擇水提時間3h為宜。

2.6 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

不同的提取次數(shù)對多糖提取率的影響結果見圖6。

圖6 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on polysaccharides yield

由圖6可知，隨著多糖提取次數(shù)的增加，多糖提取率也逐漸增加，但在提取了兩次之后，多糖幾乎全部溶出，考慮到降低成本和提高效率，選擇提取的次數(shù)為2次。

2.7 響應面優(yōu)化實驗結果

2.7.1 響應面實驗方案與結果 在單因素實驗的基礎上，對水提時間、水提溫度、微波時間、微波功率進行了四因素三水平響應曲面實驗設計，實驗設計與結果見表2。

表2 Box-Benhnken中心組合實驗設計及芋頭多糖提取率結果Table 2 Box-Benhnken experimental design matrix and corresponding experimental values of taro polysaccharides yield

2.7.2 回歸模型的有效性及顯著性分析 利用Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，計算得出回歸模型進行方差分析和方程各項系數(shù)及方差分析(表3)。

表3 回歸模型方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Variance analysis of regression equation and significance test for regression coefficients

經過擬合得到多糖提取率的預測值(y)對編碼自變量X1、X2、X3和X4的二次多元回歸方程如下:

對上述回歸模型進行方差分析(表3)，結果表明:模型高度顯著(p＜0.01)，失擬檢驗不顯著，回歸模型的調整確定系數(shù)為0.9514，說明該模型能夠解釋95.14%的變化，因此，可用此模型對芋頭多糖的提取率進行分析和預測。

從表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知:上述方程中一次項X2、X4高度顯著，X3處于顯著水平，且影響程度依次為X2＞X4＞X3＞X1;二次項X12、X22和X32高度顯著，X42處于顯著水平，交互項X1X2、X1X4和X2X3不顯著，X1X3、X2X4顯著，X3X4高度顯著。即水提時間(X1)與微波功率(X3)的交互作用、水提溫度(X2)與微波處理時間(X4)的交互作用和微波功率(X3)與微波處理時間(X4)的交互作用對實驗指標影響顯著。

對二次回歸方程進行優(yōu)化，剔除二次完全回歸方程中的不顯著因子 X1、X1X2、X1X4和 X2X3，得到新的二次回歸方程為:

Y=-65.17858+0.96573X2+0.0779707X3+0.24748X4-1.85×10-3X1X3+1.975×10-3X2X4-2.7X3X4-0.56608X12-6.84833×10-3X22-6.52333×10-3X32-1.96083×10-3X42

RSM圖形是特定的響應值Y對應自變量構成的一個三維空間圖，為更直觀地反映水提時間與微波功率(X1X3)、水提溫度與微波處理時間(X2X4)和微波功率與微處理波時間(X3X4)三個交互作用對多糖提取率的影響規(guī)律，分別將模型中其他兩個因素固定在0水平，繪制出相應的三維曲面圖，如圖7～圖9所示。

圖7直觀的給出了水提時間和微波功率交互作用的響應面圖，等高線沿微波功率軸變化相對密集，說明微波功率的影響比水提時間的影響大。因為微波功率大小直接影響分子的破壁，只要分子能夠有效的破壁，多糖能夠很快的溶出。

圖7 水提時間(X1)與微波功率(X3)對多糖提取率影響的響應曲面Fig.7 Response surface showing the interactive of water extraction time(X1)and microwave power(X3)on polysaccharides yield

當水提時間為3h，微波功率為400W時，水提溫度和微波處理時間對多糖提取率的影響見圖8。在等高線圖中可以看出水提溫度軸變化相對密集，故水提溫度的影響比微波處理時間的影響大。當水提溫度為80℃時，處理時間在70～90s范圍內，多糖提取率隨著微波時間的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。而當微波時間一定時，水提溫度在70～90℃范圍內，指標逐漸增加，達到極大值后逐漸下降。

圖8 水提溫度(X2)和微波處理時間(X4)對多糖提取率影響的響應曲面Fig.8 Response surface showing the interactive of water extraction temperature(X2)and microwave time(X4)on polysaccharides yield

由圖9的等高線的形狀可以直觀的看出微波功率和微波處理時間的交互作用顯著。且沿著微波功率軸變化相對密集，因此微波功率的影響比微波處理時間的影響大。當微波處理時間一定時，微波功率在300～500W范圍內，隨著微波功率的增大，提取率逐漸增加，達到極大值后逐漸下降。但過高的微波功率和過長的微波處理時間都會造成提取液的迅速升溫而導致部分多糖分解從而降低多糖的提取率。

圖9 微波功率(X3)與微波處理時間(X4)對多糖提取率影響的響應曲面Fig.9 Response surface showing the interactive of microwave power(X3)and microwave time(X4)on polysaccharides yield

2.7.3 二次回歸模型的驗證實驗 在上述實驗范圍內，隨意選取5組數(shù)據(jù)，在對應條件下用回歸方程求出回歸值(或預測值)Y，再與實驗值進行比較，見表4。

經過驗證實驗值與模型計算值，平均誤差為±0.87%，證明用Design-Expert中的Box-Behnken中心組合實驗設計求得多糖提取率的數(shù)學模型是可行的，該數(shù)學模型可應用于實際多糖提取工藝的分析預測。

表4 實測值與預測值的比較Table 4 Comparison between predicted and experimented results

對優(yōu)化的二次回歸模型進行數(shù)學分析，得到最大響應值對應的因素條件:水提時間為3.06h、水提溫度為81.62℃、微波功率為394.80W、微波處理時間為77.03s，此時芋頭多糖提取率的理論最大值為5.58%。考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為水提時間3h、水提溫度82℃、微波功率395W、微波處理時間77s，在此條件下進行了3次平行驗證實驗，得到芋頭多糖提取率平均值為5.57%，與理論預測值相對誤差小于0.5%，說明采用RSM優(yōu)化得到的多糖提取工藝條件參數(shù)準確可靠，按照建立的模型進行預測在實踐中是可行的。

3 結論

本實驗通過響應曲面法優(yōu)化微波輔助熱水浴法提取芋頭中非淀粉多糖的提取工藝，采用糖化酶和液化酶結合的方法去除提取多糖時溶出的淀粉。由于這兩種酶很好的專一性，且對于淀粉的酶解表現(xiàn)出很強的高效性，因此在保證迅速去除淀粉的同時很好的保留了非淀粉芋頭多糖。而且這兩種酶酶解淀粉的產物均為單一的葡萄糖，因此對于由不同單糖組成的非淀粉類的多糖的作用效果甚微。響應面實驗結果表明微波處理時間、微波功率和水提溫度對多糖的提取率影響均顯著，各因素對芋頭多糖提取率的影響順序為水提溫度＞微波處理時間＞微波功率＞水提時間。水提時間和微波功率、水提溫度和微波處理時間、微波功率和微波處理時間交互作用對多糖提取率影響顯著;多糖的最佳提取工藝條件為:水提時間為3h、水提溫度為82℃、微波功率為395W、微波處理時間為77s，此時芋頭多糖的實際平均提取率為5.57%。與理論預測值的相對誤差小于0.5%。通過驗證實驗說明所建立的模型可很好在實踐中進行預測。

［1］中科院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第五冊)［M］.北京:科學出版社，1980.

［2］孫忠偉，張燕萍.芋頭淀粉的分離純化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(3):117-121.

［3］李雅臣，李德玉，吳壽金.芋頭化學成分的研究［J］.中草藥，1995，26(10):555.

［4］LEE K Y，LEE M H，CHANG I Y.Macrophage activation by polysaccharide fraction isolated from Salicornia herbacea［J］.J Ethnopharmacol，2006，103(3):372-378.

［5］何余堂，潘孝明.植物多糖的結構與活性研究進展［J］.食品科學，2010，31(17):493-496.

［6］Yamamoto，Shima，T Uozumi，et al.A possible role of lipid peroxidation in celluler damage caused by cerebral damages caused by cerebral ischmia and the protective effect of alphataopherol administration［J］.Stoke，1993，14(6):977-980.

［7］趙國華，陳宗道.芋頭多糖的理化性質及體內免疫調節(jié)活性研究［J］.中國食品學報，2002，2(3):21-25.

［8］王喻，高暢，張娜，等.芋頭多糖的提取及生物活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(6):73-75.

［9］楊秀芳，伍發(fā)云.芋頭多糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化［J］.陜西科技大學學報，2009，27(1):61-64.

［10］蔣文明，李愛軍，汪輝，等.微波輔助堿液提取仙草多糖［J］.食品科學，2011，32(4):11-14.

［11］SPIGNOG，F(xiàn)AVERI DM.Microwave-assisted extraction of tea phenols:a phenomenological study［J］.Journal of Food Engineering，2009，93(4):482-486.

［12］RUI H，ZHANG L Y，LI Z W，et al.Extraction and characteristics of seed kernel oil from white pitaya［J］.Journal of Food Engineering，2009，93(4):482-486.

［13］楊小舟，張繼，楊曉龍，等.微波輔助提取黃參多糖的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(9):319-322.

［14］劉敏，郭麗梅，張麗.苯酚-硫酸法測定油松花粉多糖含量研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(6):1526-1528.

［15］慕運動.響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用［J］.鄭州工程學院學報，2001，22(3):91-94.

［16］Montgomery D C.Design and analysis of experiments［M］.New York:John Wiley and Sons，2005.

［17］陳紅，張艷榮，王大為，等.微波協(xié)同酶法提取玉米須多糖工藝的優(yōu)化研究［J］.食品科學，2010，31(10):42-46.

［18］王安良，云霞，楊紅.響應曲面法優(yōu)化山藥中多糖的微波提取工藝［J］.食品科技，2007(12):86-89.