睪丸高表達蛋白質(zhì)HSD13調(diào)節(jié)CHO細胞系周期進程

宋 偉，胡廷徽，繆時英，王琳芳

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室生物化學與分子生物學系，北京100005)

精子發(fā)生是在有性生殖的雄性動物睪丸中完成的特殊分化過程，歷經(jīng)精原細胞增殖、精母細胞減數(shù)分裂和精子細胞變形3個階段。精子發(fā)生過程高度復(fù)雜而有序，生精細胞內(nèi)多種基因參與調(diào)節(jié)該過程并發(fā)揮著決定性作用［1－3］。近年來的研究表明，細胞周期相關(guān)基因通過調(diào)節(jié)生精細胞的增殖與凋亡，在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，其過表達或缺失表達會影響生殖細胞發(fā)育為成熟精子［4－5］。因此，研究參與調(diào)節(jié)細胞周期的睪丸高表達基因的功能特征，對闡明精子發(fā)生的分子機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Balb/c小鼠(中國醫(yī)學科學院動物研究所)，小鼠SPF級(合格證號:0202399)。CHO細胞系中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。人睪丸cDNA文庫由王琳芳教授實驗室構(gòu)建。正常成人組織mRNA的Northern印跡雜交膜基因組北方中心。HSD13兔多克隆抗體王琳芳教授實驗室自制。β-actin兔多克隆抗體、山羊抗兔IgG和免疫組化檢測試劑盒均中杉金橋生物技術(shù)有限公司。pEGFPN1真核表達載體為王琳芳教授實驗室保存。G418和脫氧胸苷均sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 HSD13基因的克隆:將從人睪丸特異表達ESTs庫(本室構(gòu)建)中選擇的一個EST進行BLAST比對。從結(jié)果中選取人類相關(guān)序列存檔，并將其全長比對所有人類EST序列，獲得大量新ESTs。通過“Unigene”篩選其中睪丸組織來源的EST，并存檔。用DNAMAN軟件分析存檔下的人類相關(guān)序列和睪丸組織來源ESTs，獲得HSD13基因，GenBank注冊號為AY251163。設(shè)計引物(上游引物:5'-ATCATGC CACCCTCAAAGCCT-3';下游引物:5'-CCCATCCC TAGTTTAACAGTCACGG-3')，從人睪丸 cDNA文庫中擴增HSD13基因。

1.2.2 Northern blot分析:擴增、純化并通過放射性32P標記雜交特異性探針。Northern印跡雜交膜進行68℃預(yù)雜交30 min，雜交2 h。2×SSC/0.5%SDS溶液室溫洗膜3次，每次15 min;0.1×SSC/0.1%SDS溶液68℃洗膜2次，每次20 min。將濕膜置于保鮮膜內(nèi)，壓X線膠片，－70℃曝光。

1.2.3 Western blot分析:12%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。HSD13抗體以1∶1 000稀釋，4℃下反應(yīng)過夜。山羊抗兔IgG以1∶10 000稀釋，室溫1 h。化學發(fā)光法(ECL)曝光。

1.2.4 小鼠睪丸切片的制備及免疫組化染色:10%多聚甲醛固定小鼠睪丸48 h后進行石蠟包埋切片。切片常規(guī)二甲苯脫臘、水化。具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.5 CHO穩(wěn)定細胞系的建立:確定CHO細胞的G418致死濃度。將相應(yīng)的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h后加入致死濃度的 G418。每2～3天換液1次，直到長出肉眼可見的細胞克隆。用無菌牙簽挑取細胞克隆進行分別培養(yǎng)，EGFP融合蛋白通過觀察綠色熒光確定為穩(wěn)定細胞系。

1.2.6 細胞同步化:采用雙胸苷同步化方法將CHO細胞同步化于G1/S期。細胞生長至指數(shù)生長期時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為2 mmol/L的脫氧胸苷。作用12 h后換成正常培養(yǎng)基。間隔8～10 h后再次加入終濃度為2 mmol/L的脫氧胸苷。作用12 h后釋放，使絕大部分細胞同步化于G1/S期。

1.2.7 細胞周期分析:細胞同步化處理后，以釋放的時間計為零點，間隔不同時間收集細胞。清洗后以0.5 mL PBS重懸細胞，迅速打入5 mL 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定過夜。清洗后以0.5 mL PBS重懸細胞，分別加入RNaseA和PI至終濃度50μg/mL，37℃孵育30 min。用流式細胞儀測定細胞周期。

2 結(jié)果

2.1 HSD13基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)的基本特征

HSD13基因是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的一個人睪丸特異性EST，通過電子克隆的方法獲得的具有完整讀碼框的新基因，提交 GenBank登錄號為AY251163。該基因 cDNA全長為1 220 bp，其中開放閱讀框包含993 bp;編碼一個由330個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其N端包括1個纖維結(jié)合蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域(FN3)，C端由6個錨蛋白重復(fù)序列(ANK1-6)組成。

2.2 HSD13蛋白在睪丸組織中高表達

HSD13在11種成年人組織，包括心、腦、肝、肺、骨骼肌、胰腺、子宮、前列腺、宮頸、卵巢和睪丸中，在人睪丸組織中高表達，并且存在1.4和0.7 kb兩個轉(zhuǎn)錄本(圖1A)。HSD13蛋白質(zhì)在9種小鼠組織，包括骨骼肌、脾、肝、心、腦、腎、附睪、睪丸和胃中，在小鼠睪丸組織中高表達(圖1B)。

2.3 HSD13蛋白表達定位于生精細胞中的精原細胞和初級精母細胞

睪丸組織結(jié)構(gòu)良好，對照組無陽性染色，實驗組HSD13特異性的分布于精原細胞和處于減數(shù)分裂前的初級精母細胞胞質(zhì)中(圖2)。

2.4 建立HSD13過表達和對照穩(wěn)定CHO細胞系

選擇真核表達載體pEGFP-N1構(gòu)建HSD13-GFP融合表達載體。將該載體和對照載體分別轉(zhuǎn)染CHO細胞，于轉(zhuǎn)染后24 h加入0.5 mg/mL的G418進行篩選，1周后進行流式無菌分選各分出8 000個GFP+細胞，擴增培養(yǎng)后即為對照和HSD13過表達和對照穩(wěn)定細胞系(圖3A，B)。HSD13過表達穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功(圖3C)。

2.5 HSD13蛋白可顯著加速CHO細胞系的G2/M期進程

利用HSD13過表達和對照的CHO穩(wěn)定細胞系研究該蛋白對細胞周期的影響。將兩種細胞用脫氧胸苷同步化于G1/S期，釋放后用流式細胞儀觀察不同時相的細胞周期改變。結(jié)果顯示，與對照穩(wěn)定細胞系相比，HSD13過表達細胞系在釋放后6 h開始出現(xiàn)G2/M期加快現(xiàn)象，在釋放后8 h達峰值(圖4A，B)。

3 討論

HSD13基因是王林芳教授實驗室通過電子克隆方法得到的具有完整讀碼框的新基因，GenBank注冊號為 AY251163。該基因的 cDNA全長為1 220 bp，讀碼框編碼330個氨基酸。Northern印跡雜交實驗結(jié)果顯示HSD13為睪丸高表達基因，并且存在2個轉(zhuǎn)錄本，其中1.4 kb轉(zhuǎn)錄本豐度較高，0.7 kb轉(zhuǎn)錄本豐度較低，表明其存在變位剪接現(xiàn)象。人睪丸免疫組化結(jié)果顯示，HSD13主要表達定位于生精細胞中的精原細胞和初級精母細胞胞質(zhì)中，提示該蛋白可能參與精原細胞的增殖與分化過程，并且可能與精母細胞的減數(shù)分裂相關(guān)。

SMART數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ank1蛋白質(zhì)由1個FN3結(jié)構(gòu)域和6個ANK結(jié)構(gòu)域組成。FN3結(jié)構(gòu)域由大約100個氨基酸組成，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)通?？梢詤⑴c細胞表面結(jié)合或作為受體酪氨酸激酶及細胞因子受體發(fā)揮重要作用［6－7］。ANK結(jié)構(gòu)域由約33個氨基酸組成，是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用基序。研究表明許多參與調(diào)節(jié)細胞周期的蛋白質(zhì)都含有ANK結(jié)構(gòu)域，如P53-binding protein2、Cyclin-dependent kinase inhibitor P19Ink4d和NF-kappaB inhibitory protein IkB-alpha 等［8－10］。 因 此，研 究HSD13蛋白質(zhì)對細胞周期的影響。首先成功構(gòu)建了該蛋白過表達和對照的穩(wěn)定CHO細胞系。利用兩種細胞系進行細胞周期的研究結(jié)果顯示，HSD13過表達可以明顯加快細胞的G2/M期進程，提示該蛋白質(zhì)參與細胞周期的調(diào)控。已有研究表明，許多細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在精子發(fā)生過程中調(diào)控著生精細胞的增殖和凋亡，從而精密而有序的調(diào)節(jié)精子的發(fā)育成熟［11］。例如，細胞周期蛋白(cyclin)和細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)正性調(diào)節(jié)生殖細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂活動;細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)通過控制 cyclin/CDK復(fù)合物的活性而抑制細胞周期的期相轉(zhuǎn)變［12－13］。

本研究結(jié)果表明，HSD13作為一個睪丸高表達蛋白質(zhì)，可能通過調(diào)節(jié)生精細胞周期在精子發(fā)生的特定階段發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果為進一步探索其在生精過程中的分子機制提供了依據(jù)。

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