基于IgY的ELISA用于囊尾蚴循環(huán)抗原的檢測

劉 玉，王元倫，唐雨德

囊尾蚴病是我國常見的寄生蟲病，俗稱囊蟲病，其循環(huán)抗原(circulating antigen，CA)可以反映囊尾蚴在體內(nèi)的存活狀況［1］，可以用于囊尾蚴病的診斷與療效考核［2，3］。IgY是特定抗原免疫產(chǎn)蛋母雞后在雞卵黃中形成的多克隆抗體，即卵黃抗體(immunoglobulin Y)。本文應(yīng)用抗囊尾蚴CA的IgY和酶標(biāo)記抗CA單克隆抗體1A5組合，建立一種新型雙抗體夾心ELISA檢測囊尾蚴CA，以探討IgY用于囊尾蚴病免疫診斷的可行性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 血清與抗體 經(jīng)CT和藥物治療結(jié)合確診的囊尾蚴病患者樣品158份(其中血清139份，腦囊尾蚴病患者腦脊液19份)，分別獲自內(nèi)蒙古通遼囊蟲病醫(yī)院、南京腦科醫(yī)院、南京軍區(qū)總醫(yī)院和南京454醫(yī)院;經(jīng)剖檢確診的囊尾蚴病病豬血清222份，采自內(nèi)蒙古興安盟科右前旗;健康人血清50份，采自南京的健康體檢人員;健康豬血清20份，采自江蘇鎮(zhèn)江某部隊(duì)農(nóng)場;3份弓形蟲病患者血清由濟(jì)南軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所提供，8份包蟲病患者血清由新疆軍區(qū)防疫隊(duì)提供?？鼓椅豺蔆A單克隆抗體1A5由本課題組制備并保存［4］。

1.2 囊尾蚴 CA 由課題組采用親和層析法純化［3］，-20℃保存;弓形蟲與棘球蚴純化抗原分別由濟(jì)南軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所與新疆軍區(qū)防疫隊(duì)贈(zèng)與。

1.3 抗囊尾蚴CA-IgY的制備與鑒定 取500 μg CA與等體積福氏完全佐劑乳化經(jīng)翅下靜脈注射25周齡來亨蛋雞10只(首次劑量為500 μg/只，加強(qiáng)劑量為200 μg/只)，每次間隔10 d。首次免疫7 d后開始收集雞蛋。用水稀釋法提取IgY［5-6］，－20℃保存?zhèn)溆?。采用紫外吸收法測定純化后IgY的濃度，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析其相對分子量和純度，間接ELISA檢測IgY的活性與特異性。

1.4 血清處理方法 采用IC沸浴法［4］。

1.5 抗囊尾蚴CA單克隆抗體1A5的酶標(biāo)記 采用簡易過碘酸鈉法［4］標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)，HRP為Sigma公司產(chǎn)品。

1.6 IgY-ELISA的方法建立 將IgY按常規(guī)包被ELISA反應(yīng)孔中，洗板后，用100 g/L的脫脂奶粉液(或牛血清清蛋白)37℃封閉2 h，PBS-T液洗滌3次;加入已處理的待測標(biāo)本100 μl，37℃溫育30～60 min后，PBS-T液洗滌3次;加入稀釋好的HRP-1A5100 μl，37 ℃ 溫育 30 ～60 min，PBS-T 液洗滌 5次，采用TMB顯色方法，測定吸光值(A450)。每板均設(shè)陽性對照和陰性對照，以A值＞陰性對照的2.1倍作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。通過正交試驗(yàn)來確定最佳檢測條件，設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，每因素設(shè)2個(gè)水平，分別為IgY包被濃度、血清溫育時(shí)間、酶標(biāo)抗體濃度和加酶標(biāo)抗體后溫育時(shí)間。

1.7 方法的敏感性與特異性 用已建立的方法檢測囊尾蚴病患者血清、腦脊液、病豬血清以及健康人與健康豬血清以及3份弓形蟲病患者血清、8份包蟲病患者血清并與雙單抗-ELISA［4，7］比較，驗(yàn)證方法的敏感性、特異性與可行性。

2 結(jié)果

2.1 抗囊尾蚴CA-IgY的鑒定 首次免疫后10 d卵黃內(nèi)檢測到有特異性抗囊尾蚴CA-IgY，加強(qiáng)免疫后效價(jià)逐步上升，至30 d，瓊脂擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1∶128，并維持到55 d。每枚蛋黃經(jīng)提純后可得到約66.12 mg IgY，經(jīng)SDS-PAGE分析，純化后的IgY在約65 ku處和25 ku處可見2條清晰的條帶，分別為IgY的重鏈和輕鏈(圖1)。間接ELISA顯示IgY與囊尾蚴CA發(fā)生特異反應(yīng)，ELISA效價(jià)大于108，與棘球蚴抗原、弓形蟲抗原反應(yīng)的ELISA效價(jià)小于10。

圖1 lgY純化前后SDS-PAGE分析1:低分子量蛋白標(biāo)志物;2:純化前IgY;3:純化后lgY

2.2 雙抗體夾心ELISA方法的建立 經(jīng)正交試驗(yàn)最終確定的檢測條件為:IgY包被濃度1∶1000、被檢血清溫育時(shí)間為60 min;酶標(biāo)記單抗?jié)舛葹?∶800，溫育時(shí)間為30 min。

2.3 靈敏度 IgY-ELISA和雙單抗-ELISA檢測囊尾蚴 CA 的靈敏度分別為8.3 μg/L 和13.9 μg/L。

2.4 方法的敏感性與特異性 應(yīng)用IgY-ELISA和雙單抗-ELISA對450份樣品檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表1)。

表1 基于IgY和雙單抗的夾心ELISA檢測結(jié)果比較

3 討論

囊尾蚴CA的檢測可作為療效考核指標(biāo)［2-3］。建立高敏感性和特異性的CA檢測方法是當(dāng)前囊尾蚴病防治中亟待解決的問題之一?，F(xiàn)有的囊尾蚴CA檢測方法敏感性與特異性還有待提高，其原因可能是因?yàn)镃A多為囊尾蚴的代謝分泌物，易受到機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除，從而導(dǎo)致CA在患者血清中含量不高，獨(dú)特型抗體的存在也能影響到循環(huán)抗原的檢測［8-9］。此外，囊尾蚴CA與棘球蚴抗原存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)［9-10］。應(yīng)用單克隆抗體作為檢測系統(tǒng)，解決了特異性問題，但敏感性降低，而使用多克隆抗體作為檢測系統(tǒng)，其特異性較差［11］。

本實(shí)驗(yàn)利用IgY的優(yōu)點(diǎn)［5］，制備出抗囊尾蚴CA的高效價(jià)IgY抗體，SDS-PAGE與間接ELISA結(jié)果顯示，純化效果較好，可與CA發(fā)生特異反應(yīng)，而與棘球蚴和弓形蟲抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)。利用純化的抗囊尾蚴CA-IgY作為捕獲抗體、酶標(biāo)記單抗1A5為檢測抗體，建立了檢測囊尾蚴CA的夾心ELISA法。其靈敏度為8.3 μg/L，高于雙單抗-ELISA 的13.9 μg/L。從表1可知，IgY-ELISA對139例囊尾蚴患者血清、19例腦囊尾蚴患者腦脊液和222份囊尾蚴病豬血清進(jìn)行檢測，CA陽性率分別為100.0%、89.5%和100.0%，而雙單抗-ELISA的陽性率分別為97.8%、84.2% 和 100.0%;對 50 份非疫區(qū)正常人與20份健康豬的血清檢測，CA陰性率均為100%，而雙單抗-ELISA則分別為98%和100.0%。兩種方法對弓形蟲病患者和包蟲病患者血清檢測，結(jié)果均為陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，IgY-ELISA與雙單抗-ELISA的敏感性與特異性沒有顯著性差異，但前者的靈敏度似高于后者。

從理論上分析，本文所建立的檢測方法采用多抗與單抗夾心的檢測模式，多抗針對抗原的位點(diǎn)多［12］，用作捕捉抗體可以提高檢測的敏感性;而單抗針對抗原的位點(diǎn)單一，用作檢測抗體則可以提高檢測的特異性［13］。由于雞與哺乳動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)關(guān)系較遠(yuǎn)，且IgY制備及純化技術(shù)簡單、成熟，卵黃中提取的IgY純度高、含量大，將IgY應(yīng)用于免疫診斷中，可減少假陽性的出現(xiàn)［14］，從而提高檢測的敏感性與特異性。

［1］ Galan-Puchades MT，F(xiàn)uentes MV.Diagnosis of human cysticercosis and Taenia asiatica［J］.Am J Trop Med Hyg，2009，81(6):1165.

［2］ Sciutto E，Hernandez M，Garcia G，et al.Diagnosis of porcine cysticercosis:A comparative study of serogical tests for detection of circulating antigen and viable parasites［J］.Vet Parasitol，2011，78(3):185-194.

［3］ 顧志香，唐雨德，劉 玉，等.根據(jù)循環(huán)抗原檢測結(jié)果進(jìn)行囊尾蚴病的療效考核［J］.中國公共衛(wèi)生，1999，15(11):62-64.

［4］ 劉 玉，唐雨德，顧志香，等.囊尾蚴病循環(huán)抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，19(5):471-476.

［5］ 李敏惠，鄒 強(qiáng)，楊淑霞，等.雞卵黃抗體IgY的分離純化及鑒定［J］.生物學(xué)雜志，2009，26(6):80-82.

［6］ 康亦兼，咸 漠，李文興.水稀釋法分離卵黃IgY［J］.吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(3):2245-2247.

［7］ 楊 楠，劉 玉.豬囊蟲病循環(huán)抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的穩(wěn)定性觀察［J］.東南國防醫(yī)藥，2004，6(5):257-258.

［8］ 潘麗紅，王海民.囊尾蚴病免疫學(xué)診斷的研究進(jìn)展［J］.華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)，2011，13(1):38-40.

［9］ 徐 鵬，張曉雷，趙權(quán)囊.囊蟲病免疫診斷檢測方法的研究進(jìn)展［J］.中國病原生物學(xué)雜志2011，1(2):55-58.

［10］ DaSilva AD，Quagliato EM，Rossi CL，et al.Aquan-titative enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)for the immunodiagnosis of neurocysticercosis using a purified fraction from taenia solium cysticerci［J］.Diagn Mierobiol Infect Dis，2009，37(2):87-93.

［11］ Sato MO，Cavalcante TV，Sako Y，et al.Evidence and potential for transmission of human and swine Taenia solium cysticercosis in the Piracuruca region，Piaui，Brazil［J］.Am J Trop Med Hyg，2006，75(5):933-935.

［12］劉 玉，唐雨德，王 平，等.人源和豬源血清中囊蟲循環(huán)抗原的免疫和理化性質(zhì)比較［J］.東南國防醫(yī)藥，2007，9(2):134-135.

［13］ Handali S，Klarman M，Gaspard AN，et al.Multiantigen print immunoassay for comparison of diagnostic antigens for taenia solium cysticercosis and taeniasis［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17(1):68-72.

［14］李旭旭，崔 晶，井豐軍，等.抗旋毛蟲肌幼蟲ES抗原IgY的制備及鑒定［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26(11):1028-1031.