葡萄根癌病研究進展

施文驍，王洪凱，郭慶元

(1.浙江大學農業(yè)與生物技術學院生物技術研究所，浙江杭州 310058;2.新疆農業(yè)大學農學院，新疆烏魯木齊 830052)

葡萄根癌病是溫帶葡萄種植區(qū)的一個極具破壞性、毀滅性的病害，由細菌侵染引起，可在葡萄藤上存活并繁殖，并能引起葡萄產量的下降，甚至導致葡萄藤的枯死［1］。早期對歐洲或美國的葡萄根癌病的描述和報道都來自Hedgecock［2］。但在1897年，Cavara［3］首次證明，造成意大利葡萄根癌病的病原是一種傳染性細菌 (Bacillus ampelopsorae)。1907年，Smith等［4］在美國首次從巴黎的菊花上分離到了根癌病病原菌，研究發(fā)現(xiàn)，將病原菌接種到多種植物上，均能表現(xiàn)出致瘤性。1948年，Braun和Mandle通過試驗證明了Agrobacterium tumefaciens的致病因子的存在;1973年，Panagopoulos和Psallidas比較了分離自葡萄和來源于其他植物的根癌農桿菌的菌株，證明了侵染葡萄的菌株與其他根癌農桿菌的菌株在遺傳上有明顯差別。到1990年，Ophel和Kerr將侵染葡萄的根癌農桿菌的菌株定為一個新種 Agrobacterium vitis。雖也有報道 A．rhizogenes可引起葡萄根癌病，且來自分子和脂肪酸的研究表明，A．vitis和A．rhizogenes的親緣關系很近，但大量試驗確認，葡萄根癌病的主要的病原菌是 Agrobacterium vitis［5-6］。

1 葡萄根癌病的癥狀及侵染循環(huán)

1.1 癥狀

葡萄根癌病主要癥狀是形成葡萄根部的癌腫。病原菌可在傷口侵入植物體內，進而導致植物細胞產生過量的植物生長激素，從而生成根瘤或其他次生增大。可存在于易感染的植物組織和根部，也可在枝條等部位也會產生癌腫。當其存在于植物根部時，可破壞植物根冠對水和礦物元素的吸收，導致植物生長不良。此外，病害還會侵染葡萄植株的形成層和維管組織，影響營養(yǎng)的運輸和葡萄藤的健康。葡萄根癌病會使葡萄逐漸枯梢，嚴重時可導致藤蔓死亡。發(fā)病時，樹干下部的韌皮部細胞也會因病而亡，導致類似環(huán)剝的影響［7］。

1.2 侵染循環(huán)

該病的病原菌是一種細菌，主要通過傷口或孔口進入植物體內，引起系統(tǒng)性侵染。受病原菌感染的植物部位可一直保持正常，直至該部位受傷。造成傷口的原因很多，如冷凍損傷、移植栽培、修剪維護等原因是造成葡萄發(fā)病的重要誘因。農事措施如藤條嫁接、抹芽等也會造成傷口，從而被病原菌侵染而存在病癥。

葡萄根癌病的初次發(fā)病通常在初夏。根癌病的侵染分為3個步驟。首先是病原體進入植物的非原質體部位。葡萄土壤桿菌會特別集中在葡萄的根際，且一般通過根和地下傷口部位進行侵染［8-9］。第2步為細菌在木質部的定殖。葡萄土壤桿菌系統(tǒng)地定殖在葡萄植株上，并通過木質部的液流散布到植株的各個部位［10-11］。第3步包括了對植物反應的逃避以及對植物防衛(wèi)機制的抑制。例如，細菌的katA基因編碼的過氧化氫酶可降解植物所產生的過氧化氫［12-13］。根據(jù)侵染部位和發(fā)病條件的不同，病害迅速發(fā)展時，癌腫在一個生長季即可環(huán)繞葡萄藤一圈，而發(fā)展緩慢時，這個過程則需要幾年。當秋天來臨時，癌腫會變得干燥、暗黑色并壞死。

葡萄根癌病的病原菌平時存在于葡萄周圍的土壤中，可在葡萄的根部越冬。病原菌通過感染地下根冠及受傷部分，入侵到植物體內并通過維管束感染植物其他部位的細胞。隨后，冠癭、根癌會在植物生長的過程中逐步形成。隨著枯死的莖與藤的掉落與轉移，病原菌也隨之轉移。在土壤中至少生活2年以上。隨著葡萄植株上新的傷口的產生，從而侵染其他的葡萄植株。

2 病原菌的致病機制

葡萄根癌病菌可在葡萄植株的根部定殖，并通過維管束散布到整株植株，同時可自主逃避植物的防御反應。Agrobacterium vitis擁有大量的Ti和Ri質粒，這些質粒上編碼的蛋白是致病因子的來源。T-DNA可進入植物細胞的核基因，進而表達TDNA編碼植物激素形成的酶［14］。

2.1 T-DNA侵入到植物細胞

葡萄根癌病菌從傷口侵染的過程中，隨著寄主傷口的愈合，完成T-DNA的轉化，之后隨寄主細胞的分裂出現(xiàn)癥狀。在葡萄生產管理過程中，或自然逆境下，如嫁接導管連接的發(fā)展和嫁接時的組織修復和重建，凍害以及葡萄園設備所造成的物理傷害等過程都可造成傷口。這些傷口愈合過程中可形成愈傷組織，而癌腫也隨之產生［14-15］。在果園中，腫瘤的生長通常會出現(xiàn)在接穗愈合的周圍、植株的下部軀干和扦插去頂?shù)牟课?，因這些部位都會出現(xiàn)傷口愈合，同時又對T-DNA的侵入高度敏感。

Ti質粒上存在著毒力基因，這些基因表達的蛋白在T-DNA轉移中起到重要的作用［15-18］。在這些毒力基因中，VirA和VirG是雙組分的檢測體系，VirA是傳感蛋白，VirG為轉錄的生長調節(jié)劑，VirA在特定的職務酚類物質的作用下引起傷口愈合，VirG能增加所有毒力基因的轉錄;VirD4和virB的蛋白為轉移T-DNA和其他毒力蛋白所必需;VirD2是T-DNA傳輸過程中的引導蛋白，而VirE2為腫瘤形成所必需［13，19］。

2.2 T-DNA整合到植物核基因上

葡萄根癌病T-DNA轉移到植物核基因中誘導癌腫形成的［20］。整合到植物染色體中的細菌 TDNA含有植物生長素和細胞分裂素的基因可導致植物細胞生長素 (吲哚-3-乙酸)和細胞分裂素的高水平表達，2個基因的過量表達會使葡萄藤形成腫瘤［21-22］。

植物生長素需要2個生化途徑來合成。第一步是iaaM基因的表達，這誘導了色氨酸單加氧酶的產生。隨后色氨酸單加氧酶將色氨酸轉化成吲哚乙酰胺。第2步則是iaaH基因表達吲哚乙酰胺的水解酶。隨后吲哚乙酰胺水解酶將吲哚乙酰胺轉變成植物生長素。植物體內的T-DNA的表達以及激素產生水平的提高打斷了常規(guī)的細胞循環(huán)。這是因為植物細胞不能對T-DNA的表達進行調控。這些反常的植物細胞增殖導致了植物癌腫的生成［13］。

3 葡萄根癌病的防治和檢測

3.1 檢測

對葡萄根癌病進行快速準確的檢測是進行病害防治的前提，也是早期防治預警和預防的基礎。當病原菌潛伏在土壤中時，通過各種手段將土壤中的病原菌檢測出來，在發(fā)病前對其進行根除。

通常對病原菌的鑒定主要是通過PCR的方法，而病原細菌主要進行擴增的基因則是16 S～23 S及其周圍序列。但農桿菌的Agrobacterium tumefaciens，Agrobacterium vitis，Agrobacterium rhizogenes 3 個主要的致病種中，其16 S基因的序列很相似。分析IVS在23rRNA基因中的差別發(fā)現(xiàn)，其中存在有長和短2種類型，在A.V中有一些的長型和A.T很相似，同時在A.V中有另一些的長型和A.R很相似;有2個A.V菌株中同時含有這2個類型的IVS，且含有A.T和A.R的IVS。這說明在農桿菌的不同種中，基因可進行水平轉移并重組。而A.T在這3個種當中的可變度最高，說明通常的檢測手段是行不通的。目前研究已發(fā)現(xiàn)很多的新引物可用于進行葡萄根癌病的病原菌檢測［23-28］。

3.1.1 PCR方法的早期檢測

設計一對特異性引物可以對根癌病進行快速檢測。根據(jù)TMR位點的特異性和敏感性可獲得1對檢測根癌農桿菌的引物。在測試的細菌中，只有A．tumefaciens可產生236 bp目標片段。特異性PCR系統(tǒng)的敏感性由一個巢式PCR擴增決定，這可控制模板DNA的拷貝數(shù)［29］。virD2基因也可作為根癌農桿菌檢測的特異性基因，并可通過定量PCR的方法對其進行檢測［30］。擴增生物群1根癌農桿菌的T-DNA上的基因5和TMS2之間的243-bp的DNA片段可用來進行葡萄根癌病的檢測。這些引物與菌株毒力100%正相關，而與無毒的100%負相關，從而有利于實時 PCR的檢測［31］。一個葡萄土壤桿菌特異性DNA片段 (pAVS3)可通過引物URP2R來進行PCR多態(tài)性條帶的擴增。通過從不同的土壤桿菌屬物種的基因組DNA進行Southern雜交證實，該片段在A．vitis中具有特異性。再設計引物，通過巢氏PCR對其進行檢測［32］(表1)。因此，通過病原菌上的特異片斷可對該病進行早期的檢測。

表1 用于PCR檢測的特異性引物

3.1.2 電子鼻的檢測

所謂的電子鼻是一個能夠進行固相微量取樣的探頭，取樣后可以直接與氣質色譜分析連用。從而區(qū)別健康和感病的葡萄植株。感病的葡萄植株中可以將肉桂酸脫羧成苯乙烯，而正常植株中不含這種氣體。通過頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜法分析目標葡萄植株樣品的揮發(fā)性物質的特性。主成分分析證實了被感染的葡萄藤和健康的葡萄藤的揮發(fā)物質的區(qū)別［33］。

3.2 防治方法

3.2.1 普通方法

由于細菌生長在木質部中，所以目前為止沒有有效的化學防治方法［7］。防治葡萄根癌病主要在于預防，預防葡萄植株受傷和同時維護健康的藤蔓，除去死亡和生病的組織可減輕病害的發(fā)生。

3.2.2 基因工程

現(xiàn)在基因工程的方法在很多領域都得到應用，也包括對葡萄根癌病的防治。

基因工程能輔助葡萄育種，產生抗病和抗逆的葡萄。目前全球對葡萄需求的增加促使了這門科學的快速發(fā)展。將外源基因轉化葡萄并進行表達，從而使葡萄獲得抗逆性和抗病性。例如抑制病原菌的轉基因植物表達抗菌肽。盡管轉基因植物的抗逆性并不是很強，但相比非轉基因的防治，MAG-2或MSI99基因表達使得癌腫的發(fā)病率下降［24］。

將葡萄根瘤農桿菌的致病基因突變后轉入葡萄植株中，可提高對根癌農桿菌的抗性［25］。根據(jù)幾個以前的嵌入T-DNA的VirE2輸出整合阻礙理論研究顯示，抗性提高是因為突變的VirE2蛋白和功能的VirE2蛋白的競爭的聯(lián)系。在植物細胞內，競爭的出現(xiàn)阻礙了T-DNA進入整合到植物細胞核中［15-18］。

3.2.3 生物防治

生物控制是防治葡萄根癌病最有效的方法之一，采用非致病細菌菌株接種到葡萄植株及其生長的土壤中，從而達到減輕或防止根癌農桿菌為害［26］。

目前已有20多個生防菌株用于防治葡萄根癌病。放線菌株產生的K84就是生物防治的一個代表，但k84并不能完全成功的控制住葡萄根癌病。Rahnella aquatilis(水生拉恩氏菌)的菌株HX2可對葡萄根癌病進行生物防治，抑菌的主因是產生了一種抗菌物質，它與其他菌株相比能產生較大的抑菌圈及較低的最低抑菌濃度，能抑制Agrobacterium vitis中RNA和蛋白質的合成。有多種非致病的農桿菌亦可對葡萄根癌病進行生物防治［13，27］。

4 小結

隨著生活水平的提高，人們對農產品安全和環(huán)境要求更高，葡萄根癌病的防治引起人們的重視。葡萄根癌病作為土傳病害，傳統(tǒng)的防治方法防控效果不盡人意。生物防治對環(huán)境的影響小，對葡萄產品安全，但無論使用天然菌株的生物控制，或轉基因拮抗菌株的生物控制，或利用轉基因的葡萄來防止葡萄根癌病，這些方法至今還在進一步研究中。因此，通過基因工程和生物防治方法來選育抗性品種是預防葡萄根癌病發(fā)生的有效方法之一。同時開展快速檢測方法的研究，可對該病害早期快速準確檢測和提早預警，在剛發(fā)病甚至未發(fā)病時做到發(fā)現(xiàn)并消除病原，從而達到有效防控的效果。

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