EGCG對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制作用及機(jī)制

魏 芳，劉 浩，張 配，蔣國(guó)君，馬琳艷，陳 超

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233030)

三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)均不表達(dá)的乳腺癌亞型。有報(bào)道其生物學(xué)行為具有高侵襲性、惡性程度高、治療棘手等特點(diǎn)［1］?；即诵腿榘┑牟∪藷o(wú)法從內(nèi)分泌治療和抗HER2的靶向治療中獲益，因此化療在TNBC的全身治療中起重要作用［2］。如何提高此類患者的治療效果，篩選治療三陰乳腺癌的天然藥物是醫(yī)學(xué)臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。茶葉作為一種傳統(tǒng)的“醫(yī)食同源”的保健飲料，同時(shí)也是一種常用的中藥，其具有多種生物學(xué)活性和藥理效應(yīng)，如抗突變、抗腫瘤、抗炎抗病毒及清除自由基和抗氧化等作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這些作用主要是由茶多酚介導(dǎo)的，包括黃烷醇、黃烷雙醇、黃酮類和茶多酚酸類，其中大部分是黃烷醇，通稱為兒茶素［3］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯［(－)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是茶葉特有的兒茶素，其含量最高，約占兒茶素的50%左右，而且生物活性最強(qiáng)［4］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究EGCG對(duì)體外培養(yǎng)的三陰乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231的增殖抑制作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，由中山大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青工程材料有限公司、EGCG、Hoechst 33258染色試劑盒購(gòu)自Sigma公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒，Caspase-3檢測(cè)試劑盒、JC-1檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。GRP78、caspase-3單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，β-actin單克隆抗體為艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗為武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)熱電公司);倒置熒光顯微鏡IX-71(日本Olympus公司);BioTek酶標(biāo)儀(德國(guó)Synergy HT公司);Milli-Q Biocel超純水儀(美國(guó)Millipore公司);Mini-Prote電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司);細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥液配制 MDA-MB-231細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%滅活新生牛血清、100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。EGCG以DMEM培養(yǎng)液稀釋至終濃度使用。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組，細(xì)胞對(duì)照組，10、20、40、80、160 mg·L－1EGCG 5個(gè)濃度處理組每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，0.25%胰酶溶液充分消化后用DMEM培養(yǎng)液稀釋成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107·L－1，細(xì)胞對(duì)照組和藥物處理組每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，空白對(duì)照組加入100 μl培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板，接種過(guò)程細(xì)胞懸液保持吹打和晃動(dòng)使細(xì)胞分布盡量均勻，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，棄掉原培養(yǎng)基，向每孔加入含藥培養(yǎng)基100 μl放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48 h 作用結(jié)束后，加入10 μl的 CCK-8，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60 min后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率。腫瘤細(xì)胞存活率/%=(處理組A值－對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值－空白對(duì)照組A值)×100%，通過(guò)IC50計(jì)算軟件計(jì)算IC50值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，以 1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板，20、40、80 mg·L－1EGCG作用24、48 h后，吸出培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，加4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS漂洗2次，加入1 ml終濃度為10 mg·L－1的 Hoechst33258染色液，避光染色30 min，PBS漂洗2次，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)檢測(cè) JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入20、40、80 mg·L－1EGCG 作用24、48 h 后，PBS 洗兩遍，按試劑盒說(shuō)明加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液和1 ml JC-1染色工作液混勻，37℃孵育20 min，孵育結(jié)束后用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入培養(yǎng)液，冰浴保存，30 min內(nèi)在熒光顯微鏡觀察，JC-1單體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529 nm;JC-1聚合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)為585 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 caspase-3活性檢測(cè) caspase-3活性檢測(cè)試劑盒采用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中caspase-3活性。casepase-3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroani-line)，從而可以通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)檢測(cè)caspase-3的活性，具體檢測(cè)步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western 印跡法檢測(cè) GRP78、caspase-3 蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，8×105個(gè)/孔，加入不同濃度EGCG作用48 h后，終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入75 μl細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。確定上樣蛋白約30 μg，10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，50 V濕轉(zhuǎn)120 min轉(zhuǎn)至PVDF上，用5%脫脂牛奶的封閉液4℃封閉過(guò)夜。洗膜后，加入兔抗GRP78抗體(1∶500稀釋)過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)反應(yīng)2 h。按照MILLIPORE公司Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒說(shuō)明，將化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液A和B兩種試劑等體積混勻涂抹于PVDF膜上。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以±s表示，組間差異采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 EGCG對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用 實(shí)驗(yàn)中觀察了5個(gè)濃度的EGCG在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制的量效和時(shí)效關(guān)系，結(jié)果表明 10、20、40、80、160 mg·L－1EGCG作用隨著其濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，見Fig 1。作用12、24、48 h后的IC50分別為 69.1、40.4、29.4 mg·L－1。

Fig 1 Effects of EGCG on cell viability of MDA-MB-231

3.2 Hoechst33258染色觀察EGCG作用后細(xì)胞凋亡的形態(tài) Hoechst 33258染色觀察，對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)正常，細(xì)胞發(fā)出淡藍(lán)色熒光，染色均勻，隨著EGCG濃度的增加，逐漸出現(xiàn)各期凋亡細(xì)胞形態(tài):細(xì)胞核皺縮變形，染色質(zhì)濃集，部分細(xì)胞呈現(xiàn)致密濃染，呈現(xiàn)高度凝聚、邊緣化，甚至裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，且中濃度和高濃度組在細(xì)胞數(shù)量上也明顯減少(Fig 2)。

Fig 2 The morphological changes of MDA-MB-231 apoptosis induced by EGCG(stained with Hoechst 33258 ×200)

3.3 EGCG對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降。結(jié)果顯示:EGCG刺激MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，隨著濃度的增加，與陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照藥CCCP作用后相比40，80 mg·L－1EGCG組紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變較明顯(Fig 3)。

3.4 EGCG對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞caspase-3活性的影響 通過(guò)caspase-3活性檢測(cè)試劑盒對(duì)EGCG作用48h后caspase-3的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明:EGCG低濃度作用時(shí)caspase-3的活性激活不明顯，中、高濃度EGCG均可明顯增強(qiáng)caspase-3的活性(Fig 4)。

3.5EGCG 對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞 GRP78、caspase-3蛋白表達(dá)的影響 40、80 mg·L－1EGCG作用48 h后通過(guò)Western blot檢測(cè)GRP78、caspase-3蛋白表達(dá)情況，從見Fig 5可看出，EGCG隨著劑量的增加可明顯抑制GRP78蛋白的表達(dá)，而活性caspase-3蛋白表達(dá)是明顯增強(qiáng)的。

Fig 3 Effects of EGCG on mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231(stained with JC-1 ×200)

4 討論

TNBC占所有乳腺癌患者的15% ～20%，在我國(guó)近1/4患者為三陰乳腺癌。TNBC具有侵襲性高、惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、預(yù)后差、生存率低等特點(diǎn)。目前對(duì)于TNBC在臨床上仍然沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，關(guān)于TNBC治療的靶點(diǎn)和靶向藥物研究也非常有限［5］。

很多研究表明［6－9］EGCG在體內(nèi)體外具有較好的抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了EGCG對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位變化以及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulatd protein 78，GRP78)和活性caspase-3表達(dá)的影響，結(jié)果表明EGCG能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

Fig 4 Effects of EGCG on activities of caspase-3 in MDA-MB-231

文獻(xiàn)報(bào)道［10－11］，抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要有線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑和死亡受體誘導(dǎo)的外源性途徑。腫瘤細(xì)胞由于生長(zhǎng)旺盛常處于糖缺乏，酸中毒和低氧狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞中低糖基化，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)。GRP78 是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)分泌的一種蛋白，是公認(rèn)的ERS中最重要、最具有代表性的應(yīng)激蛋白之一，其作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的分子伴侶，參與新合成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和高級(jí)結(jié)構(gòu)折疊及跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于ERS時(shí)，GRP78 大量表達(dá)［12］，目前許多研究證實(shí)［13－14］，在肺癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中，ERS誘導(dǎo)通路的持續(xù)活化可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，引起對(duì)化療藥物的耐藥性增加。有文獻(xiàn)報(bào)道［15－17］，下調(diào)GRP78可逆轉(zhuǎn)腫瘤多重耐藥，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此，抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生過(guò)強(qiáng)的ERS可能是治療腫瘤更有前景的潛在靶點(diǎn)［18－19］。

Fig 5 Effects of EGCG on expression of GRP78 and a-caspase-3 in MDA-MB-231

本研究發(fā)現(xiàn)40，80 mg·L－1EGCG刺激 MDAMB-231細(xì)胞48h明顯下調(diào)了GRP78的表達(dá)，提示EGCG所引起的細(xì)胞凋亡可能與抑制了MDA-MB-231細(xì)胞過(guò)度的ERS有關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGCG能明顯抑制三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖，其機(jī)制可能與抑制GRP78蛋白表達(dá)，增強(qiáng)caspase-3活性誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。那么EGCG能否通過(guò)抑制ERS增強(qiáng)三陰乳腺癌對(duì)化療藥物的敏感性，其機(jī)制如何，還需要進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)深入研究，以期為臨床聯(lián)合應(yīng)用化療藥物治療三陰乳腺癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和聯(lián)合用藥策略。

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