綠原酸對(duì)高脂乳誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗形成的影響

梁秀慈，孟 文，鐘英麗，黃 林，何莞嫣，王 征

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指外周組織及其靶器官對(duì)胰島素(Insulin，INS)的敏感性及反應(yīng)性降低，即正常劑量的INS產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。胰島素抵抗不僅是一種代謝疾病，而且是高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等代謝疾病之間的紐帶，更是Ⅱ型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)和伴隨性狀［1］。近幾年胰島素抵抗患者人數(shù)成指數(shù)倍增加，如何防治胰島素抵抗具有重要的意義。

綠原酸是一類多酚類化合物，日常飲料如綠茶、苦丁、咖啡及常見的中草藥如金銀花、杜仲中含量都非常豐富［2］，作為植物的次生代謝物，具有抗氧化、抗菌消炎、降糖、降血脂等多種功效［3－4］。近幾年有研究表明［5－7］，含有綠原酸的天然產(chǎn)物或植物提取物有減緩Ⅱ型糖尿病形成的作用。本實(shí)驗(yàn)在同時(shí)灌胃綠原酸和高乳脂劑的情況下，通過檢測(cè)胰島素敏感指數(shù)、血脂、相關(guān)基因的表達(dá)以及靶器官組織細(xì)胞形態(tài)變化等方面來探討綠原酸是否能抑制或緩解小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 含量98%綠原酸(長(zhǎng)沙湘資生物科技有限公司)，小鼠胰島素ELISA試劑盒(美國RD進(jìn)口分裝)，甲基硫氧嘧啶、DEPC(sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，TRizol(Invitrogen公司)，丙二醇、膽固醇、谷氨酸鈉(上海國藥)，引物(華大基因有限公司)，TC測(cè)定試劑盒、TG測(cè)定試劑盒、HDL-C測(cè)定試劑盒、LDL-C測(cè)定試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.2 主要儀器 Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀［賽默飛世爾(上海)儀器有限公司］，羅康全優(yōu)越型血糖儀及試紙(德國羅氏診斷公司)，BS-200全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，PCR儀(Eppendorf)

1.3 動(dòng)物分組及給藥 SPF級(jí)昆明小鼠，♀，30只，體質(zhì)量(30.56±1.40)g，由湖南斯萊克景達(dá)公司提供(動(dòng)物許可證:HNASLKJ20100773)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，小鼠隨機(jī)分組:①對(duì)照組(Control)每天灌胃0.6 ml蒸餾水和10 ml·kg－1的生理鹽水;②綠原酸干預(yù)組(CGA+HFE)0.6 ml高脂乳劑和20 mg·kg－1的綠原酸;③高乳脂組(HFE)每天灌胃0.6 ml高脂乳劑和10 ml·kg－1的生理鹽水。自由進(jìn)食，每天監(jiān)測(cè)飲水飲食，每周測(cè)小鼠體重。根據(jù)文獻(xiàn)［8］中報(bào)道進(jìn)行改進(jìn)，高脂乳劑配方:豬油20 g，丙二醇30 ml，甲基硫氧嘧啶2 g，膽固醇5 g，果糖10 g，谷氨酸鈉1 g，蔗糖5 g，蛋白質(zhì)2 g，吐溫80 20 ml，定容至200 ml。

1.4 口服糖耐量實(shí)驗(yàn) 于實(shí)驗(yàn)第28天，禁食12 h，尾部采血測(cè)空腹血糖，給予Control組和HFE組灌胃生理鹽水及CGA+HFE組灌胃20 mg·kg－1綠原酸并每組小鼠灌胃2.5 g·kg－1的葡萄糖，測(cè)定15、30、60、120 min 的血糖值。

1.5 動(dòng)物的處死 于實(shí)驗(yàn)第30天，禁食12 h，給予60 mg·kg－1劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，拔眼球取血，獲得血清。解剖，取肝臟、胰腺、骨骼肌、腎臟用于生化試驗(yàn)和生理切片。

1.6 血清胰島素敏感指數(shù)及胰島素抵抗指數(shù) 用小鼠Elisa試劑盒檢測(cè)血清中的胰島素含量。胰島素敏感指數(shù)ISI=ln［1/(FBG×FINS)］及胰島抵抗指數(shù)HOMA-IR=(FBG ×FINS)/22.5

1.7 血脂含量的測(cè)定 用TC、TG、HDL-C和LDLC測(cè)定試劑盒在BS-200全自動(dòng)生化分析儀上分別測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

1.8 生理切片及免疫組化 用10%的甲醛將腎臟和胰腺固定后，包裝成石蠟切片。腎臟和胰腺的石蠟切片用HE染色法進(jìn)行染色。胰腺的石蠟切片經(jīng)抗原修復(fù)后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.9 RT-PCR 采用Trizol法提取肝臟和骨骼肌的mRNA，用第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板擴(kuò)增合成目的片段。G-6-Pase的上游引物:CACCTTGACACTACACCCTT，下 游 引物:GCATGGCGGTTGACTTTA，產(chǎn)物片斷大小 361bp;GLUT4的上游引物:ACTGGCACTTCCACTGAAC，下游引物:TGCTCCCTATCCGTTCTT，產(chǎn)物片斷大小384bp;β-actin的上游引物:GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT，下游引物:TGATCCACATCTGCTGGAAG，產(chǎn)物片斷大小295bp。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間均數(shù)用T檢驗(yàn)比較。

2 結(jié)果

2.1 體重變化 分組后，第3周起，3組小鼠體重開始有差異;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CGA+HFE組體重最輕，但3組之間的體重差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 綠原酸對(duì)口服糖耐量的影響 CGA+HFE組空腹血糖值明顯低于Control組(P＜0.05)和模型組(P＜0.01);灌糖2 h后，CGA+HFE組血糖值明顯低于HFE組(P＜0.05)。見Tab 1。

2.3 綠原酸對(duì)胰島素敏感指數(shù)的影響 HFE組的FINS明顯高于Control組 (P＜0.05)，也高于CGA+HFE組，但兩者差異無顯著性。HFE組的ISI明顯低于Control組 (P＜0.01)和CGA+HFE組 (P＜0.01)。CGA+HFE組的 HOMA-IR明顯低于HFE組(P＜0.01)，同時(shí)也低于Control組。見Tab 2。

Tab 1Comparison of OGTT of mouse in three groups(±s，n=10)

Tab 1Comparison of OGTT of mouse in three groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;ΔP＜0.05 vs HFE group

Group OGTT/mmol·L －1 0 min 15 min 30 min 1 h 2 h Control 3.90 ±0.61 9.40 ±1.11 8.90 ±1.19 6.30 ±1.19 4.40 ±0.65 CGA+HFE 3.00 ±0.34＊＊Δ 10.03 ±2.19 9.166 ±3.66 7.80 ±1.09* 4.73 ±0.45Δ HFE 4.27 ±0.78 9.02 ±1.35 10.44 ±1.41 8.06 ±1.22* 5.80 ±0.36＊＊

Tab 2 Level comparison of FINS，ISI and HOMA-IR in blood serum of mouse in three groups(±s，n=10)

Tab 2 Level comparison of FINS，ISI and HOMA-IR in blood serum of mouse in three groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;ΔΔP＜0.01 vs HFE group

Group FINS/μg·L －1ISI HOMA-IR Control 16.12 ±1.44 －4.09 ±0.17 2.71 ±0.45 CGA+HFE 17.48 ±3.27 －3.95 ±0.09ΔΔ 2.32 ±0.22ΔΔ HFE 19.33 ±2.18* －4.40 ±0.25＊＊ 3.74 ±1.07*

2.4 空腹血清血脂水平 HFE組血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量高于Control組，其中后3項(xiàng)指標(biāo)差別明顯(P＜0.05);CGA+HFE組相對(duì)Control組而言，TC、LDL-C雖有所升高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CGA+HFE組與HFE組比較，TG和LDLC明顯降低(P＜0.05)，TC也一定程度降低。見Tab 3。

Tab 3 Content comparison of TG，TC，HDL-C，LDL-C in blood serum of mouse in three groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;ΔP＜0.05 vs HFE group

2.5 肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)的改變 HFE組肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)量較Control組明顯升高(P＜0.05);CGA+HFE組與HFE組比較，肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05)。見Fig 1。

Fig 1 Comparison of G-6-Pase mRNA expressions in liver in three groups

2.6 骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)的改變 HFE組骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)量較Control組明顯下降(P＜0.01);CGA+HFE組與HFE組比較，骨骼肌GLUT4 mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào) (P＜0.01)。見Fig 2。

Fig 2 Comparison of GLUT4 RNA expressions in skeletal muscle in three groups

2.7 腎臟HE染色 Control組的腎小球、腎小管及間質(zhì)都正常，見Fig 3A;CGA+HFE組腎小球腎小管無異常改變，見Fig 3B;HFE組腎小球肥大，腎小球彌漫分布玻璃樣物質(zhì)，腎小球基質(zhì)膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，見Fig 3C。

Fig 3 Comparison of pathological changes of glomerulus in three groups(×400)

2.8 胰腺HE染色及β細(xì)胞免疫組化觀察 Control組和CGA+HFE組的胰腺胰島細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰;HFE組胰腺胰島細(xì)胞細(xì)胞核不清晰，核質(zhì)顏色變淡。見Fig 4。通過體視學(xué)圖像分析對(duì)胰腺β細(xì)胞免疫組化進(jìn)行分析得出，HFE組的平均灰度值明顯低于 Control組的平均灰度值 (P＜0.05)。而CGA+HFE組的平均灰度值組處于HFE組和Control組的平均灰度值之間，但均差異無顯著性(P＞0.05)見Fig 5。

Fig 4 Comparison of pathological changes of pancreas in three groups(×400)

Fig 5 Comparison of immunostaining of insulin on β-cells in pancreas in three groups(× 400)

3 討論

胰島素抵抗的形成機(jī)制復(fù)雜，它的靶器官包括肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、胰腺、脂肪組織等。研究發(fā)現(xiàn)［9－10］，長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗。肝臟G-6-Pase mRNA水平的異常升高和骨骼肌GLUT4 mRNA含量的降低是胰島素抵抗的重要標(biāo)志［11－13］。并伴隨著不同器官的損傷，例如胰島β細(xì)胞均存在INS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙［14］和腎小球肥大、彌漫性腎小球硬化、腎小管和間質(zhì)損傷、血管損害［15－16］等。本研究中，只灌胃高乳脂的實(shí)驗(yàn)小鼠與正常對(duì)照組比較，ISI指數(shù)降低，HOMA-IR、血糖血脂均升高明顯，降糖能力減弱。表明小鼠已出現(xiàn)了胰島素抵抗的基本性狀;而綠原酸干預(yù)組小鼠與之比較，各項(xiàng)指標(biāo)差別明顯。說明即使灌胃了高乳脂劑，但在綠原酸的干預(yù)下，小鼠的降糖能力得到改善、ISI指數(shù)明顯上升、HOMA-IR明顯下降、血清中的TC，TG，LDL-C水平降低、肝臟中的G-6-Pase mRNA表達(dá)量下調(diào)、骨骼肌中的GLUT4 mRNA表達(dá)量上升，而且腎臟和胰腺都未觀察到有損傷情況。結(jié)果表明綠原酸可以降低血脂，減緩糖異生;增加葡萄糖在肌肉組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用率，有效調(diào)節(jié)糖代謝過程;增加胰島素敏感性，減緩胰島素抵抗發(fā)生進(jìn)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從分子水平及細(xì)胞水平探討了綠原酸對(duì)小鼠發(fā)生胰島素抵抗的影響和作用機(jī)制，證明綠原酸能減緩小鼠胰島素抵抗發(fā)生進(jìn)程。自然界中，綠原酸分布廣泛，含量及其異構(gòu)體豐富［17］，具有潛在的預(yù)防與胰島素抵抗相關(guān)疾病的功能。我們的研究結(jié)果為開發(fā)具有降糖作用，改善胰島素抵抗的功能性食品和新藥設(shè)計(jì)提供了有意義的理論參考。

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