梁秀慈,孟 文,鐘英麗,黃 林,何莞嫣,王 征
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)
胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是指外周組織及其靶器官對(duì)胰島素(Insulin,INS)的敏感性及反應(yīng)性降低,即正常劑量的INS產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。胰島素抵抗不僅是一種代謝疾病,而且是高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等代謝疾病之間的紐帶,更是Ⅱ型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)和伴隨性狀[1]。近幾年胰島素抵抗患者人數(shù)成指數(shù)倍增加,如何防治胰島素抵抗具有重要的意義。
綠原酸是一類多酚類化合物,日常飲料如綠茶、苦丁、咖啡及常見的中草藥如金銀花、杜仲中含量都非常豐富[2],作為植物的次生代謝物,具有抗氧化、抗菌消炎、降糖、降血脂等多種功效[3-4]。近幾年有研究表明[5-7],含有綠原酸的天然產(chǎn)物或植物提取物有減緩Ⅱ型糖尿病形成的作用。本實(shí)驗(yàn)在同時(shí)灌胃綠原酸和高乳脂劑的情況下,通過檢測(cè)胰島素敏感指數(shù)、血脂、相關(guān)基因的表達(dá)以及靶器官組織細(xì)胞形態(tài)變化等方面來探討綠原酸是否能抑制或緩解小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗,并探討其相關(guān)機(jī)制。
1.1 藥品和試劑 含量98%綠原酸(長(zhǎng)沙湘資生物科技有限公司),小鼠胰島素ELISA試劑盒(美國RD進(jìn)口分裝),甲基硫氧嘧啶、DEPC(sigma),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司),TRizol(Invitrogen公司),丙二醇、膽固醇、谷氨酸鈉(上海國藥),引物(華大基因有限公司),TC測(cè)定試劑盒、TG測(cè)定試劑盒、HDL-C測(cè)定試劑盒、LDL-C測(cè)定試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。
1.2 主要儀器 Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司],羅康全優(yōu)越型血糖儀及試紙(德國羅氏診斷公司),BS-200全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司),PCR儀(Eppendorf)
1.3 動(dòng)物分組及給藥 SPF級(jí)昆明小鼠,♀,30只,體質(zhì)量(30.56±1.40)g,由湖南斯萊克景達(dá)公司提供(動(dòng)物許可證:HNASLKJ20100773)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,小鼠隨機(jī)分組:①對(duì)照組(Control)每天灌胃0.6 ml蒸餾水和10 ml·kg-1的生理鹽水;②綠原酸干預(yù)組(CGA+HFE)0.6 ml高脂乳劑和20 mg·kg-1的綠原酸;③高乳脂組(HFE)每天灌胃0.6 ml高脂乳劑和10 ml·kg-1的生理鹽水。自由進(jìn)食,每天監(jiān)測(cè)飲水飲食,每周測(cè)小鼠體重。根據(jù)文獻(xiàn)[8]中報(bào)道進(jìn)行改進(jìn),高脂乳劑配方:豬油20 g,丙二醇30 ml,甲基硫氧嘧啶2 g,膽固醇5 g,果糖10 g,谷氨酸鈉1 g,蔗糖5 g,蛋白質(zhì)2 g,吐溫80 20 ml,定容至200 ml。
1.4 口服糖耐量實(shí)驗(yàn) 于實(shí)驗(yàn)第28天,禁食12 h,尾部采血測(cè)空腹血糖,給予Control組和HFE組灌胃生理鹽水及CGA+HFE組灌胃20 mg·kg-1綠原酸并每組小鼠灌胃2.5 g·kg-1的葡萄糖,測(cè)定15、30、60、120 min 的血糖值。
1.5 動(dòng)物的處死 于實(shí)驗(yàn)第30天,禁食12 h,給予60 mg·kg-1劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,拔眼球取血,獲得血清。解剖,取肝臟、胰腺、骨骼肌、腎臟用于生化試驗(yàn)和生理切片。
1.6 血清胰島素敏感指數(shù)及胰島素抵抗指數(shù) 用小鼠Elisa試劑盒檢測(cè)血清中的胰島素含量。胰島素敏感指數(shù)ISI=ln[1/(FBG×FINS)]及胰島抵抗指數(shù)HOMA-IR=(FBG ×FINS)/22.5
1.7 血脂含量的測(cè)定 用TC、TG、HDL-C和LDLC測(cè)定試劑盒在BS-200全自動(dòng)生化分析儀上分別測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。
1.8 生理切片及免疫組化 用10%的甲醛將腎臟和胰腺固定后,包裝成石蠟切片。腎臟和胰腺的石蠟切片用HE染色法進(jìn)行染色。胰腺的石蠟切片經(jīng)抗原修復(fù)后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。
1.9 RT-PCR 采用Trizol法提取肝臟和骨骼肌的mRNA,用第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板擴(kuò)增合成目的片段。G-6-Pase的上游引物:CACCTTGACACTACACCCTT,下 游 引物:GCATGGCGGTTGACTTTA,產(chǎn)物片斷大小 361bp;GLUT4的上游引物:ACTGGCACTTCCACTGAAC,下游引物:TGCTCCCTATCCGTTCTT,產(chǎn)物片斷大小384bp;β-actin的上游引物:GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT,下游引物:TGATCCACATCTGCTGGAAG,產(chǎn)物片斷大小295bp。
1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,組間均數(shù)用T檢驗(yàn)比較。
2.1 體重變化 分組后,第3周起,3組小鼠體重開始有差異;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),CGA+HFE組體重最輕,但3組之間的體重差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.2 綠原酸對(duì)口服糖耐量的影響 CGA+HFE組空腹血糖值明顯低于Control組(P<0.05)和模型組(P<0.01);灌糖2 h后,CGA+HFE組血糖值明顯低于HFE組(P<0.05)。見Tab 1。
2.3 綠原酸對(duì)胰島素敏感指數(shù)的影響 HFE組的FINS明顯高于Control組 (P<0.05),也高于CGA+HFE組,但兩者差異無顯著性。HFE組的ISI明顯低于Control組 (P<0.01)和CGA+HFE組 (P<0.01)。CGA+HFE組的 HOMA-IR明顯低于HFE組(P<0.01),同時(shí)也低于Control組。見Tab 2。
Tab 1Comparison of OGTT of mouse in three groups(±s,n=10)
Tab 1Comparison of OGTT of mouse in three groups(±s,n=10)
*P<0.05,**P<0.01 vs control group;ΔP<0.05 vs HFE group
Group OGTT/mmol·L -1 0 min 15 min 30 min 1 h 2 h Control 3.90 ±0.61 9.40 ±1.11 8.90 ±1.19 6.30 ±1.19 4.40 ±0.65 CGA+HFE 3.00 ±0.34**Δ 10.03 ±2.19 9.166 ±3.66 7.80 ±1.09* 4.73 ±0.45Δ HFE 4.27 ±0.78 9.02 ±1.35 10.44 ±1.41 8.06 ±1.22* 5.80 ±0.36**
Tab 2 Level comparison of FINS,ISI and HOMA-IR in blood serum of mouse in three groups(±s,n=10)
Tab 2 Level comparison of FINS,ISI and HOMA-IR in blood serum of mouse in three groups(±s,n=10)
*P<0.05,**P<0.01 vs control group;ΔΔP<0.01 vs HFE group
Group FINS/μg·L -1ISI HOMA-IR Control 16.12 ±1.44 -4.09 ±0.17 2.71 ±0.45 CGA+HFE 17.48 ±3.27 -3.95 ±0.09ΔΔ 2.32 ±0.22ΔΔ HFE 19.33 ±2.18* -4.40 ±0.25** 3.74 ±1.07*
2.4 空腹血清血脂水平 HFE組血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量高于Control組,其中后3項(xiàng)指標(biāo)差別明顯(P<0.05);CGA+HFE組相對(duì)Control組而言,TC、LDL-C雖有所升高,但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CGA+HFE組與HFE組比較,TG和LDLC明顯降低(P<0.05),TC也一定程度降低。見Tab 3。
Tab 3 Content comparison of TG,TC,HDL-C,LDL-C in blood serum of mouse in three groups(±s,n=10)
*P<0.05,**P<0.01 vs control group;ΔP<0.05 vs HFE group
2.5 肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)的改變 HFE組肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)量較Control組明顯升高(P<0.05);CGA+HFE組與HFE組比較,肝臟G-6-Pase mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)。見Fig 1。
Fig 1 Comparison of G-6-Pase mRNA expressions in liver in three groups
2.6 骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)的改變 HFE組骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)量較Control組明顯下降(P<0.01);CGA+HFE組與HFE組比較,骨骼肌GLUT4 mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào) (P<0.01)。見Fig 2。
Fig 2 Comparison of GLUT4 RNA expressions in skeletal muscle in three groups
2.7 腎臟HE染色 Control組的腎小球、腎小管及間質(zhì)都正常,見Fig 3A;CGA+HFE組腎小球腎小管無異常改變,見Fig 3B;HFE組腎小球肥大,腎小球彌漫分布玻璃樣物質(zhì),腎小球基質(zhì)膜增厚,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性,見Fig 3C。
Fig 3 Comparison of pathological changes of glomerulus in three groups(×400)
2.8 胰腺HE染色及β細(xì)胞免疫組化觀察 Control組和CGA+HFE組的胰腺胰島細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞核清晰;HFE組胰腺胰島細(xì)胞細(xì)胞核不清晰,核質(zhì)顏色變淡。見Fig 4。通過體視學(xué)圖像分析對(duì)胰腺β細(xì)胞免疫組化進(jìn)行分析得出,HFE組的平均灰度值明顯低于 Control組的平均灰度值 (P<0.05)。而CGA+HFE組的平均灰度值組處于HFE組和Control組的平均灰度值之間,但均差異無顯著性(P>0.05)見Fig 5。
Fig 4 Comparison of pathological changes of pancreas in three groups(×400)
Fig 5 Comparison of immunostaining of insulin on β-cells in pancreas in three groups(× 400)
胰島素抵抗的形成機(jī)制復(fù)雜,它的靶器官包括肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、胰腺、脂肪組織等。研究發(fā)現(xiàn)[9-10],長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗。肝臟G-6-Pase mRNA水平的異常升高和骨骼肌GLUT4 mRNA含量的降低是胰島素抵抗的重要標(biāo)志[11-13]。并伴隨著不同器官的損傷,例如胰島β細(xì)胞均存在INS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙[14]和腎小球肥大、彌漫性腎小球硬化、腎小管和間質(zhì)損傷、血管損害[15-16]等。本研究中,只灌胃高乳脂的實(shí)驗(yàn)小鼠與正常對(duì)照組比較,ISI指數(shù)降低,HOMA-IR、血糖血脂均升高明顯,降糖能力減弱。表明小鼠已出現(xiàn)了胰島素抵抗的基本性狀;而綠原酸干預(yù)組小鼠與之比較,各項(xiàng)指標(biāo)差別明顯。說明即使灌胃了高乳脂劑,但在綠原酸的干預(yù)下,小鼠的降糖能力得到改善、ISI指數(shù)明顯上升、HOMA-IR明顯下降、血清中的TC,TG,LDL-C水平降低、肝臟中的G-6-Pase mRNA表達(dá)量下調(diào)、骨骼肌中的GLUT4 mRNA表達(dá)量上升,而且腎臟和胰腺都未觀察到有損傷情況。結(jié)果表明綠原酸可以降低血脂,減緩糖異生;增加葡萄糖在肌肉組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用率,有效調(diào)節(jié)糖代謝過程;增加胰島素敏感性,減緩胰島素抵抗發(fā)生進(jìn)程。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)從分子水平及細(xì)胞水平探討了綠原酸對(duì)小鼠發(fā)生胰島素抵抗的影響和作用機(jī)制,證明綠原酸能減緩小鼠胰島素抵抗發(fā)生進(jìn)程。自然界中,綠原酸分布廣泛,含量及其異構(gòu)體豐富[17],具有潛在的預(yù)防與胰島素抵抗相關(guān)疾病的功能。我們的研究結(jié)果為開發(fā)具有降糖作用,改善胰島素抵抗的功能性食品和新藥設(shè)計(jì)提供了有意義的理論參考。
[1]盧 圓,王麗紅,王 寧,等.伴胰島素抵抗的糖尿病大鼠抗氧化能力測(cè)定及臨床評(píng)價(jià)[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2009,25(6):836-7.
[1]Lu Y,Wang L H,Wang N,et al.The measurement and clinical evaluation of abtioxygenic ability of diabetic rats with insulin resistance[J].Chin Pharmacolo Bull,2009,25(6):836-7.
[2]Zhang W,Han F,He J,Duan C.HPLC-DAD-ESI-MS/MS Analysis and Antioxidant Activities of Nonanthocyanin Phenolics in Mulberry(Morus alba L.)[J].J Food Sci,2008,73(6):C512-8.
[3]Iwasaki Y,Nomoto M,Oda M,et al.Characterization of nitrated phenolic compounds for their anti-oxidant,pro-oxidant,and nitration activities[J].Arch Biochem Biophys,2011,513(1):10-8.
[4]Hebeda C B,Bolonheis S M,Naksato A,et al.Effects of chlorogenic acid on neutrophil locomotion function in response to inflammatory stimulus[J].J Ethnopharmacol,2011,135(2):261-9.
[5]Rob M.Van Dam,PHD,et al.Coffee,Caffeine,and Risk of Type 2 Diabetes A prospective cohort study in younger and middleaged U.S.women[J].Diabetes Care,2006,29(2):398-403.
[6]James A Greenberg,Carol N Boozer,Allan Geliebter.Coffee,diabetes,and weight control[J].Ame J Clin Nutr,2006,84(4):682-93.
[7]Khang Wei Ong,Annie Hsu,LiXia Song,et al.Polyphenols-rich Vernonia amgdalina shows anti-diabetic effects in streptocin-induced diebetic rats[J].J Ethnophamacol,2011,133:598-807.
[8]Jing Ai,Ning Wang,Mei Yang,et al.Development of Wistar rat model of insulin resistance [J].World J Gastroenterol,2005,11(24):3675-9.
[9]S.B.Sharma,A.Nasir,K.M.Prabhu,et al.Hypoglycaemic and Hypolipidemic Effect of Ethanolic Extract of Seeds of Eugenia Jambolana in Alloxan-induced Diabetic Rabbits[J].J Ethnopharmacol,2003,85(2-3):201-6.
[10]Ae-Sim,Seon-Min Jeon,Myung-Joo Kim et al.Chlorogenic acid exhibits anti-obesity and improves lipid metabolism in high-fat dietinduced-obese mice[J].Food Chem Toxicol,2010,48(3):937-43.
[11]DeFronzo R A,Bonadonna R C,F(xiàn)errannini E.Pathogenesis of NIDDM:A balanced overview [J].Diabetes Care,1992,15(3):318-68.
[12]李 焱,何 娟,李芳萍,等.抵抗素在肝臟胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制探討[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2009,25(2):190-3.
[12]Li Y,He J,Li F P,et al.The role of resistin in hepatic insulin resistance and the underlying mechanism [J].Chin Pharm Bull,2009,25(2):190-3.
[13]Ralph A.Defronzo,Devjit Tripathy.Skeletal Muscle Insulin Resistance Is the Primay Defect in Type 2 Diabetes[J].Diabetes Care,2009,32(2):157-63.
[14]趙家偉,馬鳳海,羅 梅.胰島D細(xì)胞胰島素抵抗的證據(jù)[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2005,21(4):附錄4a-4-5.
[14]Zhao J W,Ma F H,Luo M,et al.Evidence of islet β-cell insulin resistance[J].Chin J Endocrinol Metah,2005,21(4):4a - 4-5.
[15]Kambham N,Markowitz G S,Valeri A M,et al.Obesity-related glomerulopathy:an emerging epidemic[J].Kidney Internat,2001,59:1498-509.
[16]Henegar J R,Bigler S A,Henegar L K,et al.Functional and strucural changes in the kidney in the early stages of obesity[J].J Am Soci Nephrol,2001,12(6):1211-7.
[17]Wang Zheng,Michael N Clifford.Comparison of the Profile of Chlorogenic Acids and their derivatives from three Chinese traditional herbs by LC-MSn[J].Acta Pharm Sin,2008,43(2):185-90.