藏靈菇發(fā)酵純牛奶過程中的物性變化

袁祎琳，李云飛，2，*，梅 俊，王邦權(quán)，劉志宇

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

藏靈菇（Tibetan kefir）是一種產(chǎn)自西藏的開菲爾粒，乳白色、膠質(zhì)狀的塊狀物，外形酷似小塊花椰菜[1-2]，包含由多種微生物組成的微生態(tài)群落，對牛奶有發(fā)酵作用。開菲爾粒是一種天然形成的混菌發(fā)酵系統(tǒng)，能夠?qū)εＨ榈冗M(jìn)行乳酸發(fā)酵及酒精發(fā)酵[3]。其發(fā)酵牛乳的風(fēng)味與普通酸牛乳有較大差別，除了具有發(fā)酵牛乳特有的酸味、香味，還有輕微醇香味及起泡性[4]。藏靈菇制作酸奶飲品在西藏、青海等地區(qū)有著悠久的歷史，其傳入內(nèi)地以來引起了更多人的關(guān)注。目前，對藏靈菇的研究剛剛起步，在菌相、風(fēng)味、微觀、物性等方面缺乏相關(guān)文獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)是將民間收集的藏靈菇作為發(fā)酵劑進(jìn)行牛奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并跟蹤整個發(fā)酵過程，研究了牛奶在發(fā)酵過程中的物性變化，為研究藏靈菇發(fā)酵牛奶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏靈菇 西藏當(dāng)雄寺廟；純牛奶 光明乳業(yè)無抗生素巴氏奶。

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海-恒科學(xué)儀器有限公司；METJLER TOLEDO實(shí)驗(yàn)pH計(jì)（FE20） 儀器（上海）有限公司；Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400通用臺式離心機(jī) 上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；KDN-04A凱氏定氮儀 浙江托普儀器有限公司；SXT-06索氏抽提器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；R/S plus流變儀 美國Brookfield公司；E-1045離子濺射儀（Ion Sputter） 日立Hitachi；Sirion 200場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM） 荷蘭FEI.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵前處理 日常培養(yǎng)藏靈菇將其放于巴氏奶中，置于28℃環(huán)境培養(yǎng)，每隔24h更換一次牛奶；在實(shí)驗(yàn)前一天將藏靈菇以10g/100mL接種于純牛乳中，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，使之標(biāo)準(zhǔn)化，瀝出后用蒸餾水清洗藏靈菇表面，將白色附著物洗凈，置于蒸餾水中備用。所有備用藏靈菇在1h內(nèi)使用完。

1.2.2 發(fā)酵時間與溫度 按照15g/100mL進(jìn)行接種，然后將其放在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為28℃和34℃，發(fā)酵時間為3、6、9、12、15、18、21、24、27h。

1.2.3 pH測定 每隔3h對發(fā)酵過程中的發(fā)酵液進(jìn)行pH測定。

1.2.4 保水率（WHC） 借鑒Harte[5]對于開菲爾的保水率測定方法，30mL發(fā)酵液置于50mL離心管中，以4500g，4℃離心18min，以下公式用于計(jì)算發(fā)酵液的保水率（WHC）：

式中：W1為離心之后乳清的質(zhì)量（g）；W2為所有發(fā)酵液的質(zhì)量（g）。每個梯度兩個平行。

1.2.5 脫水收縮 參考文獻(xiàn)[6]的方法：在50mL的離心管中加入約30g左右的藏靈菇發(fā)酵液，在4℃環(huán)境中靜置2h，然后在3400g（5804R）10℃條件下離心15min，以下公式用于計(jì)算脫水收縮率：

式中：W1為離心之后乳清的質(zhì)量（g）；W2為所有發(fā)酵液的質(zhì)量（g）。每個梯度三個平行。

1.2.6 黏度分析 采用R/S plus流變儀測定藏靈菇發(fā)酵液的黏度，參數(shù)設(shè)定為25℃，剪切速率變化為5min內(nèi)0～512s-1，轉(zhuǎn)子采用CC 25，每個樣品平行做3次。

1.2.7 化學(xué)成分分析 乳糖測定采用GB方法[7]，平行操作三次，得出平均消耗樣液的體積。以下公式計(jì)算樣品中乳糖的含量：

式中：X為樣品中乳糖的含量（mg/mL）；A為堿性酒石酸銅溶液（甲、乙液各半）相當(dāng)于乳糖的質(zhì)量（mg）；v為樣品的體積（mL）；V為測定時消耗樣品溶液的平均體積（mL）；100為樣品溶液總體積（mL）。

化學(xué)成分分析蛋白質(zhì)測定參考文獻(xiàn)[8]的方法，換算系數(shù)為6.38。

1.2.8 藏靈菇的掃描電鏡觀察 將藏靈菇切成小片，大小約5.5mm，將小片置于戊二醛溶液中，25℃放置4h，進(jìn)行固定。然后用磷酸緩沖液洗滌2次，每次15min，再分別用15%、30%、50%、70%的酒精各脫水15min，再用99.5%酒精脫水1h，將脫水巖心放入臨界點(diǎn)干燥機(jī)用液態(tài)二氧化碳進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，然后用離子膜覆膜機(jī)鍍金，最后用掃描電鏡觀察。

1.2.9 藏靈菇發(fā)酵乳和市售普通酸奶（光明莫斯利安）掃描電鏡觀察 將發(fā)酵乳和市售酸奶在干凈平整的玻璃板上涂片，涂片厚度約為2mm。在通風(fēng)的恒溫箱內(nèi)（28℃）下靜置48h以上，保證完全干燥。電鏡掃描前，撬取一小塊樣品薄片在離子覆膜機(jī)鍍金，最后用掃描電鏡觀察。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 利用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平定在0.05%。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH的變化

原奶的pH為6.62，經(jīng)過27h的發(fā)酵，28℃環(huán)境中的純牛乳pH降低到3.93，34℃環(huán)境中的純牛乳pH降低到3.91。由圖1可觀察到，兩個溫度組的pH降低趨勢相似，12h之前pH的降低速度較快，12h之后降低比較平緩。此結(jié)果與王晴等[9]對kefir的研究結(jié)果相似，這是由于發(fā)酵初期乳酸菌（Lacteus）為優(yōu)勢菌種，大量利用乳糖并產(chǎn)酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳的pH大幅降低。后期由于發(fā)酵乳的酸度過高抑制了乳酸菌的生長，因此pH降低變緩。

根據(jù)SAS軟件的T TEST檢驗(yàn)，設(shè)計(jì)程序?qū)τ趦蓚€溫度進(jìn)行測試，結(jié)果顯示3～15h溫度（28、34℃）對于pH降低有顯著性影響（p＜0.05），18～27h這個時間段的溫度（28、34℃）對于pH也存在顯著性影響，但是顯著性不如前面的15h。整體上整個發(fā)酵階段溫度（28、34℃）組對于pH降低具有顯著性影響（p＜0.05），藏靈菇34℃發(fā)酵純牛奶產(chǎn)酸比28℃更快；對于發(fā)酵時間進(jìn)行測試，結(jié)果顯示兩個溫度組的發(fā)酵時間對于pH降低具有顯著性影響（p＜0.01）。

并且，由于發(fā)酵溫度不同，菌相的變化和產(chǎn)物的組成以及產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)也會有很多差別，因此每個發(fā)酵階段產(chǎn)物的感官質(zhì)量也存在差別。

圖1 藏靈菇發(fā)酵純牛奶pHFig.1 The pH of Tibetan kefir fermentation samples

2.2 保水率和脫水收縮的變化

圖2 藏靈菇發(fā)酵純牛乳的保水率Fig.2 Water-holding capacity（WHC）of Tibetan kefir fermentation samples

2.2.1 保水率（WHC） 15～27h發(fā)酵純牛乳的WHC隨發(fā)酵時間而升高（見圖2），這是由于隨著發(fā)酵時間的增長，藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖增多的緣故[10]，因?yàn)榘舛嗵牵‥PS）結(jié)合水的能力很強(qiáng)[11]。從圖2中看28℃比34℃有更高的保水率，這個結(jié)果與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果一致。28℃與34℃組的15h保水率分別為31.29%和30.48%，到了27h，兩組的保水率分別提升到了46.94%和46.22%。經(jīng)過SAS的ANOVA檢驗(yàn)，時間對于藏靈菇發(fā)酵純牛乳的保水率均有及其顯著的影響（p＜0.01）。3～12h發(fā)酵階段溫度組時間對于保水率沒有影響（p＞0.40），這可能是發(fā)酵不穩(wěn)定的緣故。整個發(fā)酵階段溫度對于保水率并沒有顯著性影響（p＞0.05）。

2.2.2 脫水收縮率 由圖3可知，發(fā)酵15～27h隨著發(fā)酵時間的增長，脫水收縮率降低。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，在發(fā)酵過程中pH降低，導(dǎo)致酪蛋白顆?？姑撍湛s能力增強(qiáng)，這應(yīng)該就是脫水收縮率隨著時間降低的原因。圖3中顯示，28℃發(fā)酵的脫水收縮率要比34℃組的略低。采用SAS的ANOVA檢測分析可知，發(fā)酵時間對于脫水收縮率的影響極其顯著（p＜0.01），而發(fā)酵溫度對于脫水收縮的影響不顯著（p＞0.05）。

圖3 藏靈菇發(fā)酵純牛乳的脫水收縮率Fig.3 The syneresis of Tibetan kefir fermentation samples

2.3 粘度的變化

從表1中可知，發(fā)酵乳的黏度隨發(fā)酵時間的延長而提高。經(jīng)過ANOVA檢驗(yàn)，發(fā)酵時間對于黏度的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對于黏度的影響也極其顯著（p＜0.01）?？梢钥吹降?5h時兩個溫度組的黏度均出現(xiàn)峰值，18h黏度又有所降低，18～27h的黏度再次穩(wěn)步上升。

藏靈菇發(fā)酵乳對于黏度的影響主要由胞外多糖和脂肪決定，整個發(fā)酵過程中胞外多糖主要由乳酸菌中的乳桿菌屬（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）的腸膜明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostocn.mesnteroidessubsp.dextranicum）產(chǎn)生[14]，腸膜明串珠菌葡聚糖亞種的最佳發(fā)酵溫度是20～30℃，提高溫度并有酵母（fermento）存在時，腸膜明串珠菌葡聚糖亞種活力增強(qiáng)。王晴等[9]研究發(fā)現(xiàn)，16h之后發(fā)酵乳中的酵母菌數(shù)明顯比12h之前的減少了很多，這點(diǎn)可能影響了明串珠菌葡聚糖亞種的生長，導(dǎo)致了胞外多糖分泌暫時受阻。又由于根據(jù)王晴等[9]的生長曲線，16h之后乳桿菌（Lactobacillus）的生長速率高于12h之前，乳桿菌的最適生長溫度為37～42℃，具有很強(qiáng)的分泌胞外多糖的能力。故此研究18h之后發(fā)酵乳的粘度再次升高，且發(fā)酵時間越長，34℃組比28℃組的黏度高的幅度越大。

經(jīng)過流變儀的檢測，市售酸奶的黏度隨時間的變化趨勢全部呈對稱的開口向上的拋物線狀（見圖4），藏靈菇發(fā)酵液黏度曲線基本都呈開口向上的不對稱拋物線狀，且拋物線的最低點(diǎn)接近600s（轉(zhuǎn)子的剪切速率接近0s-1）處。這與藏靈菇發(fā)酵的成分和微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，究其具體原因在下文電鏡掃描之后會加以解釋。酸牛乳都是觸變性流體，但是由于藏靈菇奶是由一個微生物群落發(fā)酵而成的，其成分要比市售酸奶復(fù)雜得多，并且從微觀結(jié)構(gòu)圖7（C、D、E）上也可以看出結(jié)構(gòu)致密平整，就造成了藏靈菇奶黏度恢復(fù)能力與市售酸奶有很大不同，從時間-黏度曲線上可以看出，黏度恢復(fù)能力比較滯后。

表1 藏靈菇發(fā)酵純牛乳的黏度對比結(jié)果Table 1 The viscosity of Tibetan kefir fermentation samples

圖4 市售普通酸奶和藏靈菇發(fā)酵液粘度（34℃，27h）Fig.4 The viscosity of Tibetan kefir fermentation samples andordinary yogurt（34℃，27h）

2.4 乳糖及蛋白質(zhì)的變化

2.4.1 乳糖 經(jīng)過檢測，純牛乳的乳糖含量為5.06%，經(jīng)過27h的發(fā)酵，28℃組的乳糖降低到3.42%，34℃組的乳糖降低至3.31%。從圖5中可以看出，12h之前乳糖急劇減少，15h之后乳糖雖仍在減少，但是降低的趨勢比較平緩。可能因?yàn)槿樘前l(fā)酵型酵母菌適合酸性生長環(huán)境，而乳糖非發(fā)酵型酵母只能利用葡萄糖和半乳糖[15]，導(dǎo)致開菲爾乳中乳糖含量在發(fā)酵后期下降幅度降低。經(jīng)過SAS的ANOVA檢驗(yàn)可知，整個發(fā)酵階段的時間對于乳糖含量的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵溫度對于乳糖含量的影響也極其顯著（p＜0.01），但是12h之前發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對于乳糖的含量有影響，但是不顯著（p＞0.05），15h之后發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對于乳糖含量的無影響。

圖5 雪蓮菌發(fā)酵純牛乳乳糖含量趨勢圖Fig.5 lactose of the Tibetan kefir fermentation samples

2.4.2 蛋白質(zhì) 純牛乳的蛋白質(zhì)含量為2.92%，進(jìn)過27h的發(fā)酵，34℃組的蛋白質(zhì)含量升至3.87%，然而28℃組的蛋白質(zhì)含量升至了3.93%。有學(xué)者通過胃蛋白酶體外消化實(shí)驗(yàn)表明，開菲爾發(fā)酵酸奶中，非蛋白質(zhì)氮及游離氨基酸比普通牛奶多[16]；研究發(fā)現(xiàn)，在開菲爾發(fā)酵成熟過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生變性和分解，游離氨基酸如脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸有限制增加，這可能為乳酸菌、醋酸菌中的紋膜醋酸桿菌（Acetobacter）或酵母菌作用的結(jié)果[17]。從圖6中可以看出，15h之前蛋白質(zhì)含量上升得比較快，18h之后，蛋白質(zhì)含量上升的趨勢逐漸平緩；兩個溫度組的蛋白質(zhì)含量上升的趨勢比較相似；并且28℃溫度下藏靈菇發(fā)酵純牛乳的蛋白質(zhì)含量高于34℃溫度組。

圖6 藏靈菇發(fā)酵純牛乳蛋白質(zhì)含量趨勢圖Fig.6 Protein content of the Tibetan kefir fermentation samples

經(jīng)過SAS的ANOVA分析，發(fā)酵時間對于蛋白質(zhì)含量變化的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵溫度（28℃，34℃）對于蛋白質(zhì)含量變化的影響不顯著（p＞0.05），發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用對于蛋白質(zhì)含量的影響不顯著（p＞0.05）。0～3h，6～9h，15～18h發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量有比較大幅度的上升，ANOVA分析顯示這三個溫度組的蛋白質(zhì)含量具有顯著性差別。

2.5 電鏡掃描（SEM）結(jié)果及分析

從圖7（A）和圖7B中可以看到，雪蓮菌的外觀似花椰菜花蕾形狀，形成的過程為片狀結(jié)構(gòu)→渦旋狀→花椰菜[18]。對于此種藏靈菇的電鏡掃描外觀，菌種的表層棲息的菌種為乳糖發(fā)酵型酵母（Fermento.lactose fermentescentis）、嗜溫型乳球菌（Lactococcus.mesophilic）、嗜溫型乳桿菌（Lactobacillu.mesophilic）、嗜熱型乳桿菌（Lactobacillu.thermophilus），稍進(jìn)入里層酵母和乳桿菌的比例逐漸增大直至酵母占絕對優(yōu)勢，內(nèi)層主要為非乳糖發(fā)酵型酵母（Fermento.nonlactose fermentescentis）[19]。

圖7 藏靈菇、光明莫斯利安酸奶、藏靈菇發(fā)酵純牛乳（28℃，27h）組的電掃描照片F(xiàn)ig.7 SEM of Tibetan kefir，Bright Mosley Ann yogurt，Tibetan kefir fermentation samples（28℃，27h）

藏靈菇發(fā)酵準(zhǔn)牛乳27h之后發(fā)酵液的結(jié)構(gòu)非常致密平整（見圖7E），而市售酸奶就有比較多的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（見圖7C、D），空間結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜。這也許能解釋藏靈菇發(fā)酵液粘度曲線的特殊性，由于這樣的平整主要是由多糖造成的，多糖的交聯(lián)性會促進(jìn)蛋白顆粒之間的粘合，但是這樣的結(jié)構(gòu)一旦在高速剪切力的作用之下被破壞之后，恢復(fù)的速度就比較慢，這也是為什么藏靈菇發(fā)酵液的粘度曲線在剪切速率降低的情況下還是久久不能恢復(fù)的原因。在不添加任何增稠劑的情況下發(fā)酵而得的發(fā)酵液就具有如此獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，添加了一定量的甜味劑以后，成為一種比市售酸奶更加健康、綿滑、開胃的保健酸奶。藏靈菇發(fā)酵時間越久，發(fā)酵液的質(zhì)構(gòu)就更加致密[20]。發(fā)酵溫度也會影響到藏靈菇發(fā)酵乳的致密程度，溫度高（34℃）相較于溫度低（28℃）蛋白顆粒結(jié)合更加緊密，促進(jìn)了脫水收縮，但是平整度不如低溫發(fā)酵[21]。

3 結(jié)論

3.1 發(fā)酵溫度（28、34℃）和發(fā)酵時間對降低pH和增加黏度均有顯著性或者極顯著性影響，發(fā)酵至15h黏度達(dá)到最大值，分別為0.07676Pa·s和0.07930Pa·s。發(fā)酵溫度對保水率和脫水收縮率的影響表現(xiàn)為：發(fā)酵前期無顯著性影響，但是在發(fā)酵15h后有極顯著影響。

3.2 整個發(fā)酵階段，發(fā)酵時間對于乳糖的降低影響極其顯著（p＜0.01）；發(fā)酵溫度（28、34℃）對于乳糖的影響極其顯著（p＜0.01），34℃組強(qiáng)于28℃組；發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對于乳糖的含量無顯著性影響；發(fā)酵時間對提高蛋白質(zhì)含量的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵溫度對于蛋白質(zhì)含量變化無顯著性影響（p＞0.05）。

3.3 酸牛乳是觸變性流體，但是由于藏靈菇奶是由一個微生物群落發(fā)酵而成的，其成分要比市售酸奶復(fù)雜得多，微觀結(jié)構(gòu)較市售酸奶致密平整，黏度恢復(fù)能力滯后。

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