產(chǎn)脂肪酶海洋酵母Bohaisea-9 1 4 5批式發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

郝建華，盛 軍，孫 謐

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071）

脂肪酶作為一個(gè)具有上百年歷史的古老酶種，近年來隨著細(xì)胞工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)的興起，其在生物能源、精細(xì)化工及醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，重新煥發(fā)出新的活力[1-2]。目前國內(nèi)已經(jīng)開發(fā)的脂肪酶尤其是低溫脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)并不能適應(yīng)新的使用需求，如何尋找性能更加穩(wěn)定、功能更加完善的新型替代酶是目前酶制劑行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。本課題組篩選到一株能高產(chǎn)海洋低溫脂肪酶的海洋酵母Bohaisea-9145，該酵母所產(chǎn)脂肪酶具有低溫活性高、溫度與pH穩(wěn)定性好、與復(fù)雜試劑配伍性優(yōu)良等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于化工、食品與醫(yī)療領(lǐng)域[3-4]。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型可以在很多具體代謝途徑未知的情況下根據(jù)少數(shù)可以檢測(cè)的關(guān)鍵參數(shù)來預(yù)測(cè)發(fā)酵產(chǎn)量、控制微生物反應(yīng)過程以及分析反應(yīng)過程特征等，使人們對(duì)發(fā)酵過程具有更全面、深刻的認(rèn)識(shí)，以解決工業(yè)生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的問題[5-7]。課題組通過前期單因子優(yōu)化研究獲得了海洋微生物Bohaisea-9145產(chǎn)脂肪酶的最佳發(fā)酵條件：豆餅粉4%，米糠4%，花生粕4%，粗制花生油0.5%，MgSO40.05%，KH2PO40.2%，最適培養(yǎng)溫度為（26±1）℃[3]。以此為基礎(chǔ)，本文對(duì)酵母菌Bohaisea-9145分批培養(yǎng)的細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，建立相關(guān)動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型，并解出模型參數(shù)，為產(chǎn)脂肪酶酵母菌Bohaisea-9145發(fā)酵規(guī)模放大和優(yōu)化調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Bohaisea-9145 由中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所海洋酶與酶工程實(shí)驗(yàn)室分離保存；產(chǎn)酶初始培養(yǎng)基 蛋白胨4%、葡萄糖1%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%，粗制花生油0.5%，以Na2HPO4調(diào)節(jié)pH為5.0；聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50） 天津市化學(xué)試劑三廠；橄欖油 上海醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；無水乙醇 濟(jì)南三恩化工有限公司；其他化學(xué)試劑 均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

SPS-250B型生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；工業(yè)搖床 江蘇錫山制鎖設(shè)備廠；SW-CJ型超凈工作臺(tái) 中外合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；752型紫外光柵分光光度計(jì) 上海分析儀器總廠；GC9790型氣相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司；20L-NLF22型自動(dòng)控制發(fā)酵罐 瑞士Bioengineering公司。

1.2 脂肪酶活性測(cè)定

采用中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[8]。脂肪酶水解活力單位定義為：以脂肪酶水解油脂，每分鐘產(chǎn)生1μmol脂肪酸的酶量，定義為一個(gè)脂肪酶活力單位（U）。

1.3 發(fā)酵液中葡萄糖含量測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定[9]。

1.4 發(fā)酵過程細(xì)胞濃度測(cè)定

取發(fā)酵液20mL，其中10mL在3000×g下離心15min，蒸餾水洗滌、離心2次，移菌體至恒重的稱量瓶中，至105℃烘干至恒重，稱重，即可算出細(xì)胞濃度（g/L，干重）。

1.5 其他相關(guān)發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

發(fā)酵罐中的溫度、溶氧和pH由發(fā)酵罐中相應(yīng)的電極進(jìn)行在線測(cè)量。其中溶氧為相對(duì)溶氧，以無氧水定義為0%，以滅菌后在0.4Bar、26℃時(shí)培養(yǎng)基氧濃度達(dá)到飽和時(shí)為100%。通過改變空氣通氣量、發(fā)酵罐罐壓和攪拌速度等，控制溶氧分別保持在20%±2%、30%±2%、40%±2%和50%±2%。發(fā)酵過程中每隔2h取樣一次，并測(cè)定脂肪酶酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基條件的確定

由于本研究采用20L-NLF22型自動(dòng)控制發(fā)酵罐進(jìn)行脂肪酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，為了方便研究基質(zhì)對(duì)菌體生長、代謝和產(chǎn)酶的影響，因此從篩選過的氮、碳源中選擇蛋白胨和葡萄糖作為培養(yǎng)基中的主要氮、碳源，并對(duì)培養(yǎng)基中碳源及氮源配比進(jìn)行重新優(yōu)化。根據(jù)前期工作，誘導(dǎo)劑（脂肪）及其他培養(yǎng)基成分和含量以產(chǎn)酶初始培養(yǎng)基為準(zhǔn)。菌體于（26±1）℃搖瓶培養(yǎng)23h后，測(cè)定發(fā)酵液脂肪酶活力。蛋白胨和葡萄糖對(duì)脂肪酶活力的影響見圖1。

圖1 蛋白胨和葡萄糖對(duì)脂肪酶活性的影響Fig.1 The effect of peptone and glucose on lipase activity

對(duì)結(jié)果分析并構(gòu)建三維圖形（圖1）。由圖1可知，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?%、葡萄糖濃度為1.25%時(shí)，發(fā)酵獲得最大脂肪酶活力。根據(jù)脂肪酶活力隨蛋白胨和葡萄糖起始濃度變化趨勢(shì)知，脂肪酶活力受葡萄糖濃度影響較大，而受蛋白胨濃度影響較小。尤其在蛋白胨和葡萄糖濃度較高時(shí)，脂肪酶活力隨著葡萄糖起始濃度的升高迅速下降。

2.2 發(fā)酵過程中溶氧對(duì)脂肪酶活力影響

溶氧是發(fā)酵過程中的一個(gè)重要參數(shù)。對(duì)于需氧的產(chǎn)酶菌而言，深層培養(yǎng)時(shí)需要適量的溶氧以維持其呼吸代謝和某些代謝產(chǎn)物的合成。發(fā)酵液中溶氧過低，不利于菌體的生長，表現(xiàn)為菌體生長緩慢，延遲期較長，酶的活力受到影響。而在較高的溶氧下，會(huì)使酵母菌生長過于迅速，菌體迅速生長起來而使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗，從而影響到脂肪酶的生產(chǎn)[10]。根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道，當(dāng)培養(yǎng)基中溶氧過高時(shí)甚至有可能會(huì)抑制酵母菌呼吸作用。因此有必要初步探討溶氧對(duì)脂肪酶活力的影響。

根據(jù)結(jié)果顯示（見圖2），當(dāng)發(fā)酵過程中溶氧控制在20%±2%時(shí)，菌體生長緩慢，脂肪酶的生產(chǎn)時(shí)期較其他濃度長，并且產(chǎn)酶的最高濃度比溶氧為30%±2%和40%±2%時(shí)低。推測(cè)這可能是由于發(fā)酵液中的溶氧略微偏低所致。當(dāng)溶氧為40%±2%時(shí)，脂肪酶的生產(chǎn)時(shí)間大大提前，其在發(fā)酵液中累積達(dá)到最大濃度的時(shí)間也大大縮短，但脂肪酶濃度達(dá)到最高濃度后，便迅速下降，不利于放罐時(shí)間的控制。溶解氧為50%±2%時(shí)，脂肪酶活力比40%±2%時(shí)更低。當(dāng)溶氧濃度為30%±2%時(shí)，脂肪酶活力達(dá)到最大值的時(shí)間、發(fā)酵液最高酶濃度和維持時(shí)間都較為合適，因此選定該溶氧濃度為發(fā)酵過程中的溶氧控制濃度。

圖2 溶氧對(duì)脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of dissolved oxygen concentration on lipase activity

2.3 生長曲線及代謝規(guī)律分析

發(fā)酵培養(yǎng)基為：4%蛋白胨、1.25%葡萄糖、KH2PO40.2%、MgSO40.05%，粗制花生油0.5%，以Na2HPO4調(diào)節(jié)pH為5.0。發(fā)酵過程中，控制溶氧30%±2%，溫度（26±1）℃，pH5.5。菌體濃度、脂肪酶活力和葡萄糖濃度隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線見圖3。

圖3 脂肪酶批式發(fā)酵生長動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curve of batch fermentation

一般認(rèn)為發(fā)酵產(chǎn)物形成與菌體生長的關(guān)系可分為：與生長相關(guān)聯(lián)型和與生長不相關(guān)聯(lián)型。由圖3可看出Bohaisea-9145的細(xì)胞生長曲線比較典型。各個(gè)期段比較分明，從生長曲線與耗糖曲線在細(xì)胞生長期間基本呈影鏡關(guān)系的現(xiàn)象可以推測(cè)，碳源葡萄糖是細(xì)胞生長限制性基質(zhì)[12]。而從生長曲線與酶活曲線的關(guān)系可以看出堿性脂肪酶的產(chǎn)生始于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期且隨著比生長速率下降而加速增長，由此推論Bohaisea-9145產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵類型屬于與生長非關(guān)聯(lián)型[13]。

2.3.1 模型建立與參數(shù)估算 由圖3 X-t曲線可看出，發(fā)酵過程中菌體生長的各個(gè)階段比較分明。在維持培養(yǎng)液體積基本不變的情況下，用指數(shù)方程描述指數(shù)生長期細(xì)胞的增長速率：

dX/dt=μmX0式（1）

式中，X為細(xì)胞濃度（g/L，干重）；t為時(shí)間（h）；μ為比生長速率（h-1）；μm為最大比生長速率（h-1）；X0為菌體初濃度。

將方程（1）定積分得方程：

lnX=lnX0+μmt 式（2）

根據(jù)圖3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以lnX對(duì)t作圖得一直線（y=0.2126x-1.0642，見圖4）。其中，直線斜率的物理意義為μm＝0.2126h-1，即細(xì)胞最大比生長速率；直線與縱軸的截距l(xiāng)nX0=-1.0642，則X0=0.3517g/L，其物理意義為菌體初濃度。通過圖3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立細(xì)胞濃度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系方程式：

X=0.3517e-1.045t式（3）

圖4 指數(shù)生長期lnX與t關(guān)系Fig.4 The relation between lnX and time（t）in exponential phase

微生物發(fā)酵中酶的產(chǎn)量與細(xì)胞濃度的關(guān)系密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)細(xì)胞濃度越高則酶的產(chǎn)量越大，但隨著時(shí)間的延長，過多的細(xì)胞將消耗大量的碳氮源和氧氣，從而對(duì)酶的合成產(chǎn)生影響，因此我們也要考慮產(chǎn)物生成速率與菌體增長間關(guān)系，使菌體濃度和酶產(chǎn)量達(dá)到一個(gè)平衡點(diǎn)，從而獲得最大的產(chǎn)出。

2.3.2 細(xì)胞生長速率與限制性基質(zhì)濃度間的關(guān)系 在其他培養(yǎng)條件（溫度、pH、溶氧）確定之后和非生長限制營養(yǎng)成分過量的情況下，細(xì)胞的比生長速率主要與生長限制性基質(zhì)濃度有關(guān)，尤其當(dāng)S＜＜Ks時(shí)，比生長速率與限制性基質(zhì)濃度呈線性關(guān)系[12]。根據(jù)monod模型：

其中，S為限制性基質(zhì)濃度（葡萄糖，g/L）；Ks為μ達(dá)到0.5μm時(shí)的基質(zhì)濃度。將上式變形為：

1/μ=（Ks/μm）（1/S）+（1/μm） 式（5）

圖5 1/μ與1/S關(guān)系圖Fig.5 The relation between 1/μ and 1/S

根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，并以（1/μ）對(duì)（1/S）作圖，得一直線（y=5.3554x+5.1261，見圖5）。其中，直線的斜率為Ks/μm＝5.3554，故Ks＝1.1386g/L，即當(dāng)限制性基質(zhì)葡萄糖濃度達(dá)到2.2772g/L時(shí)細(xì)胞生長速率最大，也說明在脂肪酶發(fā)酵中葡萄糖的濃度最好控制在此范圍內(nèi)，或大或小都會(huì)影響細(xì)胞的生長速度。

2.4 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)脂肪酶酵母菌Bohaisea-9145產(chǎn)生的脂肪酶是胞外酶，以酶活性高低衡量酶的活力。從分批發(fā)酵結(jié)果來看，堿性脂肪酶的產(chǎn)生始于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期。設(shè)定Bohaisea-9145發(fā)酵類型為非生長關(guān)聯(lián)型，其產(chǎn)物生成速率可表示為：

dP/dt=βX 式（6）

式中，P為產(chǎn)物濃度（酶活，μ/mL）；β為比例常數(shù)。可分別進(jìn)行在指數(shù)生長期和穩(wěn)定期的產(chǎn)酶速率估算，求得β值。

2.4.1 酵母菌產(chǎn)酶速率方程的建立 參照?qǐng)D3，2～16h可看作菌體指數(shù)生長期，此期間lnX=lnX0+μmt，故方程式（6）可改寫為：

dP/dt=βX=βX0eμmt 式（7）

對(duì)上式兩端進(jìn)行積分得：

上式兩端同時(shí)取對(duì)數(shù)得：

lnP＝（lnβ+lnX0－lnμm）lnP0+μmlnP0t 式（9）

令α＝（lnβ+lnX0－lnμm）lnP0，則上式可簡(jiǎn)化為：

lnP＝α+μmlnP0t 式（10）

其中，P0為對(duì)數(shù)期起始脂肪酶濃度（以酶活力表示，2.50μ/mL），X0=0.3517。以指數(shù)生長期內(nèi)的lnP對(duì)時(shí)間t作圖，得到一直線（y=0.1949x+0.3768，見圖6）。

圖6 lnP與時(shí)間關(guān)系圖Fig.6 The relation between lnP and time

則：μmlnP0＝0.1949，（lnβ+lnX0－lnμm）lnP0＝0.3768。經(jīng)計(jì)算：β＝0.9110。所以，酵母菌產(chǎn)酶速率方程為：

dP/dt＝0.9110X 式（11）

2.4.2 產(chǎn)物生成速率與菌體增長間關(guān)系 分析方程式（11）和圖3可知，產(chǎn)酶生成速率與菌體濃度成正比。所以發(fā)酵初期大量生長菌體和延長穩(wěn)定期時(shí)可使產(chǎn)物量（酶活）提高。根據(jù)酵母菌產(chǎn)酶速率長方程（11）分析得知：堿性脂肪酶的產(chǎn)生始于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期，并且隨著比生速率μ的減小而酶合成速率（dP/dt）逐步增大。當(dāng)μ趨近于極小值時(shí)，發(fā)酵液中活菌的濃度達(dá)到最大，酶的合成速率亦達(dá)到最大。隨著發(fā)酵進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵液中細(xì)胞的數(shù)量開始減少，酶的合成速率也開始隨之減小。雖然理論上酶的濃度仍可能會(huì)有所提高，但由于發(fā)酵液中大量有毒物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的積累，常常會(huì)使酶的合成速率很快降至零，并有可能導(dǎo)致酶的失活或降解。

3 結(jié)論

通過對(duì)產(chǎn)脂肪酶海洋酵母菌Bohaisea-9145分批發(fā)酵過程特征的分析，同時(shí)結(jié)合數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出了該菌株分批發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的菌體生長、脂肪酶產(chǎn)物合成以及限制性基質(zhì)葡萄糖濃度與細(xì)胞生長速率之間的關(guān)系，并獲得了方程中的參數(shù)值，該方程式基本能夠描述海洋酵母Bohaisea-9145分批發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的動(dòng)態(tài)過程，可以為以后的進(jìn)一步放大實(shí)驗(yàn)及連續(xù)發(fā)酵過程的優(yōu)化控制提供參考。

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