杜仲葉總黃酮微波輔助提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究

李 旭，劉 停

（南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330029）

杜仲，為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥樹皮，是中國特有的名貴滋補藥材。研究結(jié)果表明，杜仲在促進機體功能，抗衰老、抗癌等方面的效果十分明顯，尤其是對血壓的雙向調(diào)節(jié)作用，是任何化學(xué)藥物無法比擬的，屬上等的老年保健藥物，其提取物在我國作為藥食同源的保健食品成分已有廣泛使用[1]。杜仲中主要含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、多糖、氨基酸和杜仲膠等有機化合物，及鈣、鐵等無機元素[2]。其所含的黃酮類化合物是杜仲的主要有效成分之一，具有抗氧化，清除自由基的活性[3]。人工合成的抗氧化劑如BHT，TBHQ（特丁基對苯二酚）等，雖然具有較強的抗氧化能力，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它們有一定的毒性，TBHQ在日本已被禁止使用，BHT在美國也已被禁止使用。因而尋找安全、天然的食品抗氧化劑日益成為研究熱點[4]。其中，黃酮類化合物的抗氧化活性是研究的重點之一，主要表現(xiàn)在減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基[5]。杜仲不同部位中總黃酮的含量有很大的差別，以杜仲葉（尤其是老葉）中的總黃酮含量最高[6]。近年來的研究表明，杜仲葉與皮有相似的化學(xué)成分和藥理作用，可代皮供藥用，解決了杜仲藥源匱乏的問題[7]。因此研究從杜仲葉中提取黃酮的優(yōu)化工藝，對提高杜仲的經(jīng)濟價值具有較高的現(xiàn)實意義和廣泛的應(yīng)用前景。微波輔助提取作為一種新型提取工藝，在天然產(chǎn)物活性成分提取中廣泛使用[8]，它具有控制方便、升溫速度快等優(yōu)點，特別適合熱敏性物質(zhì)的提取[9-10]。響應(yīng)面分析法是應(yīng)用合理的實驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對響應(yīng)面等值線的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計分析方法[11-12]。本實驗將微波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于杜仲葉中總黃酮的提取，并通過響應(yīng)面法對杜仲葉中總黃酮的提取工藝條件進行優(yōu)化，并測定了提取物的體外抗氧化活性，為杜仲葉中總黃酮微波輔助提取制備食品用天然抗氧劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 產(chǎn)地湖南張家界，購于南昌市醫(yī)藥公司，經(jīng)南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院植物教研室黃兆祥教授鑒定為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥樹葉；柚皮苷（批號：110722-201107）標準品、橙皮苷（批號：110721-201114）標準品 購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇 為色譜純；水 為自制二次蒸餾水；其余試劑 均為分析純，購自國藥試劑有限公司。

LC-15C型高效液相色譜儀、SPD-15C紫外可見雙波長檢測器 日本島津公司；XFB500型植物粉碎機 湖南中誠制藥機械廠；N-2000（SP1版）型色譜工作站 浙江大學(xué)智達信息工程有限公司；ORW10S-3E型微波提取裝置 南京澳潤微波科技有限公司；BSA224S型電子天平 德國賽多利斯；SENCOR-205B2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；Z206A臺式低速離心機 賀默（上海）儀器科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；UV-1750型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析檢測方法

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱為Shim-pack CLC-ODS（4.6mm×150mm，5.0μm）；流動相為乙腈-0.5%乙酸溶液（pH2.90）（體積比為22∶78）；流速1.0mL/min；檢測波長283nm；柱溫35℃；收集時間10min。在該色譜條件下柚皮苷和橙皮苷的保留時間分別為8.587min和9.659min，定量方法為外標工作曲線法。

1.2.1.2 標準曲線方程的繪制[13]精密稱定柚皮苷（3.84mg）和橙皮苷（1.56mg）對照品，用甲醇溶解并定容至10mL，用0.45μm微孔濾膜過濾，作為對照品溶液。取上述配制的標準溶液，稀釋成系列濃度的對照品溶液。柚皮苷：38、77、192、307、384μg/mL；橙皮苷：16、31、78、125、156μg/mL。分別精密吸取上述對照品溶液20μL注入液相色譜儀，測定其峰面積積分值。以進樣量（μg）為橫坐標、峰面積值為縱坐標繪制柚皮苷和橙皮苷的標準曲線，得到標準曲線方程。

1.2.2 杜仲葉中總黃酮的提取與含量測定 杜仲葉原料用微型植物粉碎機打成粉末，用不同目數(shù)藥典篩過篩，在60℃條件下烘干，備用。精確稱取干燥后的杜仲葉粉末樣品5.0g，在圓底燒瓶中加入一定濃度的乙醇，在設(shè)定的實驗條件下（微波時間、微波功率、液料比和乙醇濃度等），采用連續(xù)微波輔助提取法提取杜仲葉中總黃酮。提取結(jié)束后，提取液先經(jīng)過濾分離，濾液再低速離心20min，取上清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃減壓濃縮，再定容于1L的容量瓶中。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，備用。精密吸取各供試品溶液20μL，按上述給定的色譜條件測定峰面積，以回歸方程計算含量。

1.2.3 響應(yīng)面分析 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取料液比（X1）微波時間（X2）、微波功率（X3）和乙醇濃度（X4）四個對杜仲葉總黃酮得率影響較大的因素，根據(jù)Box-Beknhen實驗設(shè)計原理，設(shè)計了4因素三水平的響應(yīng)面實驗表，總計進行29次。實驗安排見表1和表2。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉中總黃酮的微波輔助提取工藝實驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the independent variables involved in response surface analysis

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定[14]1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一種很穩(wěn)定的自由基，乙醇溶液中呈深紫色，在517nm處有最大吸收峰，遇到自由基清除劑時其顏色變淺，褪色程度與清除劑的清除能力及數(shù)量正相關(guān)。因此可用分光光度法評價物質(zhì)的抗氧化能力。

分別吸取不同濃度待測樣品的乙醇溶液2mL，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL，搖勻后，在室溫下黑暗處放置30min。以無水乙醇調(diào)零，測定517nm處的吸光度A樣。同時，測定樣品溶液2.0mL與乙醇2.0mL混合液在517nm處的吸光度A參比，再測定2.0mL DPPH溶液與2.0mL乙醇在517nm處的吸光度A空白。同一實驗重復(fù)3次，并按下式計算清除率。以抗壞血酸為對照品。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除率的測定[15]超氧陰離子自由基是生命代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，具有很強的氧化能力。鄰苯三酚在弱堿性條件下會發(fā)生自氧化反應(yīng)生成超氧自由基，從而在λ=320nm處產(chǎn)生吸收。加入的自由基清除劑能夠抑制超氧自由基的生成，從而降低所產(chǎn)生的吸光度。

取4.7mL Tris-HCl（pH=8.0）置于10mL試管中，于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入不同濃度待測品0.1mL后均加入0.2mL鄰苯三酚，混勻，水浴4min后取樣，并加入10mol/L鹽酸1滴終止反應(yīng)，在320nm處測定所取樣品吸光度A樣，實驗重復(fù)3次。用甲醇代替樣品，測得空白對照吸光度A空白。并按下式計算清除率。以抗壞血酸為對照品。

1.2.6 羥基自由基清除率的測定[16]利用H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸與·OH反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在510nm下有最大吸收。若加入具有清除自由基作用的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。

試管中依次加入6mmol/L FeSO4溶液2mL不同濃度樣品溶液2mL，6mmol/L H2O2溶液2mL，搖勻，靜置10min，再加入6mmol/L水楊酸溶液2mL，搖勻，靜置30min后于510nm處測得不同樣品濃度下的吸光度A樣，用水代替水楊酸時測得某濃度樣品濃度下的吸光度A參比，用水代替抗氧化劑時測得空白對照吸光度A空白。清除率按下式計算。以抗壞血酸為對照品。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析檢測結(jié)果

以標準品色譜峰面積（Y）對進樣量（X）進行回歸，得出柚皮苷和橙皮苷的回歸方程。柚皮苷和橙皮苷的回歸方程分別為Y=1006.1X+217.05（r=0.9992）和Y=196.49X-12.86（r=0.9996），這表明在上述溶液濃度區(qū)間內(nèi)，吸收峰面積與柚皮苷和橙皮苷的含量具有良好的線性對應(yīng)關(guān)系。標準品與杜仲葉提取物的HPLC色譜圖見圖1。

圖1 標準品（a）和杜仲葉提取物（b）的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of a mixture of naringin and hesperidin standard（a）and total flavonoids extractive（b）from Eucommia ulmoides leaf

2.2 單因素實驗

設(shè)定樣品粉末顆粒度為80目、料液比為100∶1（mL/g）、微波時間5min、微波功率800W、乙醇濃度（v/v）60%為通用提取條件，分別在固定樣品目數(shù)、料液比、微波時間、微波功率和乙醇濃度條件下，逐一考察上述因素對杜仲葉柚皮苷、橙皮苷得率的影響。實驗結(jié)果見圖2。

圖2 樣品粉末顆粒度對柚皮苷、橙皮苷得率的影響Fig.2 Effect of samples powder size on the yield of naringin and hesperidin

2.2.1 樣品粉末顆粒度對杜仲葉柚皮苷、橙皮苷得率的影響 從上述實驗結(jié)果可知，隨著樣品粉碎粒度的提高，總黃酮得率也相應(yīng)提高，但考慮到顆粒過細，后續(xù)過濾工序耗時較長，故選定樣品最佳粉碎粒度為100目。

2.2.2 料液比對杜仲葉柚皮苷、橙皮苷得率的影響從實驗結(jié)果可知，提高料液比有利于總黃酮得率的提高?？紤]到后續(xù)濃縮工藝及經(jīng)濟性，選定實驗最佳料液比為80∶1。

圖3 料液比對柚皮苷、橙皮苷得率的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on the yield ofnaringin and hesperidin

2.2.3 微波時間對杜仲葉柚皮苷、橙皮苷得率的影響 從實驗結(jié)果可知，微波時間為5min時，總黃酮得率最高，隨著微波時間的繼續(xù)增加，總黃酮得率反而出現(xiàn)明顯下降，這是由于總黃酮在高溫下不穩(wěn)定容易分解。因此選定最佳微波時間為5min。

圖4 微波時間對柚皮苷、橙皮苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of naringin and hesperidin

2.2.4 微波功率對杜仲葉柚皮苷、橙皮苷得率的影響 從實驗結(jié)果可知，微波功率為800W時，總黃酮得率最高，隨著微波功率的繼續(xù)增加，總黃酮得率反而出現(xiàn)下降，這是由于總黃酮的高溫下不穩(wěn)定，容易分解。因此選定最佳微波功率為800W。

圖5 微波功率對柚皮苷、橙皮苷得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of naringin and hesperidin

2.2.5 乙醇濃度對杜仲葉柚皮苷、橙皮苷得率的影響 從實驗結(jié)果可知，當提取劑乙醇濃度為60%時，總黃酮得率最高。增大或減小提取劑的極性，均不利于總黃酮的提取。因此選定最佳乙醇濃度60%（v/v）。

圖6 乙醇濃度對柚皮苷、橙皮苷得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on the yield of naringin and hesperidin

通過分析上述單因素實驗結(jié)果，可以初步確定杜仲葉中總黃酮的提取工藝條件為：樣品粉末顆粒度為100目，料液比為80∶1，微波時間為5min，微波功率為800W，乙醇濃度為60%（v/v）。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面曲線法對上述提取工藝進行進一步優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面曲線法優(yōu)化杜仲葉黃酮提取工藝

2.3.1 工藝評價指標 杜仲葉總黃酮是一類成分復(fù)雜的混合物，柚皮苷和橙皮苷是其中的主要成分，尤其是柚皮苷作用更加顯著，因此在本實驗中，以柚皮苷和橙皮苷的得率作為評價指標，根據(jù)總黃酮中兩者的含量，設(shè)定柚皮苷的權(quán)重系數(shù)為0.9366，橙皮苷的權(quán)重系數(shù)為0.0676。提取工藝優(yōu)化過程中，分別測定兩者的含量，再通過給出的統(tǒng)計權(quán)重計算出工藝評價參數(shù)，對優(yōu)化工藝進行評價。工藝評價參數(shù)的計算如下式所示：

2.3.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)面實驗表進行實驗，實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉中總黃酮的微波提取工藝的實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.3 模型的建立及其顯著性分析 本實驗使用了Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得到回歸方程為：Y（評價參數(shù)）=101.16+0.059X1+4.85X2-4.11X3+1.59X4-0.93X1X2-2.75X1X3-6.84X1X4-3.84X2X3-1.90X2X4-1.52X3X4-0.65X12-9.86X22-9.40X32-10.43X42。

分析表3中的數(shù)據(jù)可知，該模型的p值<0.0001，說明此模型是高度顯著的，該實驗方法是可靠的。表3的數(shù)據(jù)還說明，項X2、X3、X1X4、X22、X32、X42（p<0.05）對實驗結(jié)果影響顯著，去掉不顯著項得到回歸方程為：Y（評價參數(shù)）=101.16+4.85X2-4.11X3-6.84X1X4-9.86X22-9.40X32-10.43X42。

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由回歸方程各項方差分析可以看出，方程的失擬誤差（p<0.0001）顯著，表明失擬平方和中除還有試驗誤差外，還含有其他條件因素及其交互作用的影響，總黃酮得率與各單因素之間不僅存在一次或者二次關(guān)系，可能還存在高層次的關(guān)系，這有待今后繼續(xù)深入研究。

回歸模型預(yù)測的杜仲葉中總黃酮的微波輔助提取最佳工藝條件為：料液比60∶1（mL/g）、提取時間為5.25min、微波功率為756.16W、乙醇濃度為66.55%。在最佳條件下，杜仲葉中總黃酮提取效率評價參數(shù)可達103.323。

2.4 杜仲葉中總黃酮最優(yōu)提取工藝的驗證

將杜仲葉粉碎，過100目篩，在料液比為60∶1（mL/g）、提取時間5.3min、微波功率757W、乙醇濃度為67%（v/v）的條件下提取杜仲葉中總黃酮。平行實驗3次，進行重復(fù)驗證。柚皮苷、橙皮苷的提取量平均值分別達到69.02、4.96mg/g，綜合指標為102.354，與理論預(yù)測值103.323基本吻合，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的微波提取條件參數(shù)準確可靠，能夠指導(dǎo)實際生產(chǎn)。

2.5 杜仲葉黃酮體外抗氧化活性

從上述實驗可知，杜仲葉總黃酮中，以柚皮苷的含量最大，為計算方便，在體外抗氧化活性實驗中，以柚皮苷濃度代替總黃酮含量。

2.5.1 杜仲葉黃酮對DPPH自由基的清除作用 由圖7可知，在選定的濃度范圍內(nèi)，杜仲葉黃酮對DPPH自由基具有良好的清除能力，而且隨著杜仲葉黃酮的濃度提高，其對DPPH自由基的清除作用增強，呈現(xiàn)量效關(guān)系。根據(jù)線性回歸方程計算得到杜仲葉黃酮的IC50=157.38μg/mL，而VC的IC50=198.47μg/mL，這說明杜仲葉黃酮具有比VC更強的DPPH自由基清除能力。

圖7 杜仲葉黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Eucommia ulmoides leaf flavonoids on DPPH radicals

2.5.2 杜仲葉黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

從圖8可知，在選定的濃度范圍內(nèi)，杜仲葉黃酮對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，通過線性回歸方程得到的杜仲葉黃酮的IC50=261.67μg/mL，而VC的IC50=108.81μg/mL，這說明杜仲葉黃酮超氧陰離子自由基的清除作用弱于VC。

圖8 杜仲葉黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of Eucommia ulmoides leaf flavonoids on superoxide anion free radicals

2.5.3 杜仲葉黃酮對羥基自由基的清除作用 從圖9可知，在選定的濃度范圍內(nèi)，杜仲葉黃酮表現(xiàn)出了明顯的清除羥基自由基的能力，且作用效果隨著濃度的提高而增強，通過線性回歸方程計算得到的杜仲葉黃酮的IC50=178.44μg/mL，而VC的IC50=241.31μg/mL，這說明杜仲葉黃酮具有的羥基自由基清除作用強于VC。

圖9 杜仲葉黃酮對羥基自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of Eucommia ulmoides leaf flavonoids on hydroxyl free radicals

3 結(jié)論

3.1 利用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取杜仲葉中黃酮工藝，得到的最佳工藝條件為：料液比60∶1（mL/g）、提取時間為5.3min、微波功率為757W、乙醇濃度為67%。在此條件下，柚皮苷、橙皮苷的提取量平均值分別達到69.02mg/g和4.96mg/g，與理論預(yù)測值（103.323）基本吻合，這說明，本實驗的模型擬合程度高，準確有效，可用于杜仲葉黃酮提取工藝的優(yōu)化篩選。

3.2 體外抗氧化活性表明，杜仲葉黃酮具有較強的抗氧化能力，與相同濃度的VC比較，杜仲葉黃酮清除DPPH自由基和羥基自由基的能力明顯高于VC，且隨著濃度的增大，其清除能力增強，顯示出了較好的量效關(guān)系；但杜仲葉黃酮清除超氧陰離子自由基的能力要弱于VC。實驗中所用的杜仲葉黃酮未經(jīng)進一步純化，可以預(yù)見，經(jīng)純化后，其抗氧化IC50值會進一步降低。由此可見，杜仲葉黃酮作為天然抗氧化劑具有廣闊的開發(fā)前景。

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