酶法降解小麥秸稈堿預(yù)處理濃度的選擇及酶解產(chǎn)物的檢測(cè)

劉沙沙，李靜梅，吳 穎，石 波，*，梁 平，OJOKOH Eromosele solomon

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，北京100029）

小麥秸稈是農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物之一，是一種可重復(fù)獲得的綠色資源，主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。木質(zhì)纖維素的組成成分復(fù)雜、性質(zhì)穩(wěn)定，使得其生物降解難以迅速進(jìn)行，因此需要借助化學(xué)的、物理的方法進(jìn)行預(yù)處理，使纖維素與木質(zhì)素、半纖維素等分離開，打開纖維素內(nèi)部氫鍵，使結(jié)晶纖維素成為無定型纖維素，進(jìn)一步打斷部分β-1，4糖苷鍵，降低纖維素聚合度[1-2]。纖維素經(jīng)酸或酶水解，然后經(jīng)過分離純化可得到高純度的單一聚合度的纖維寡糖[3-5]。纖維寡糖是由2～10個(gè)葡萄糖分子通過β-1，4糖苷鍵連接起來的低聚糖，由于人體腸道內(nèi)沒有能降解β-1，4糖苷鍵的酶，因此纖維寡糖不易被人體消化吸收，屬于功能性低聚糖范疇[6]。目前，已有多種木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理的方法[7]，主要包括物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法。其中化學(xué)堿處理方法中的NaOH預(yù)處理是發(fā)現(xiàn)最早、應(yīng)用最廣、比較有效的植物纖維素原料的預(yù)處理方法[8]。De Vrije等[9]用堿70℃處理芒草后，進(jìn)行酶降解，木質(zhì)素去除率達(dá)到77%，纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，半纖維素轉(zhuǎn)化率44%；郭德憲等[10]將小麥秸稈經(jīng)過NaOH處理后，用里氏木霉產(chǎn)纖維素酶對(duì)其降解，結(jié)果經(jīng)過NaOH處理的小麥秸稈轉(zhuǎn)化率提高了15%；Weil等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NaOH有較強(qiáng)的脫木質(zhì)素作用，原料除去了木質(zhì)素后，酶水解糖化率顯著提高。本研究旨在探索小麥秸稈的最佳堿處理濃度，并對(duì)預(yù)處理后的小麥秸稈進(jìn)行酶降解及降解產(chǎn)物的分析，以提高小麥秸稈的利用率，同時(shí)為纖維類寡糖生產(chǎn)原料和方法的選擇提供一定的研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥秸稈 產(chǎn)自河北滄州；β-葡聚糖酶 酶活3000萬u/g，購(gòu)于寧夏夏盛實(shí)業(yè)有限公司；乙腈 色譜純，F(xiàn)isher；葡萄糖（純度99.8%）、木糖（純度99.0%）Sigma；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸等 國(guó)產(chǎn)分析純；水 去離子水。

IKA加熱磁力攪拌器 德國(guó)IKA；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FW100超速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；BME-100L高剪切混合乳化機(jī) 上海威宇機(jī)電制造公司；FD-1D真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；2695/2414高效液相色譜儀及示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Waters；PB-21pH計(jì) 德國(guó)Sartorius。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥秸稈的堿法預(yù)處理 稱取小麥秸稈400g，萬能粉碎機(jī)粉碎后，放在紗網(wǎng)上，用自來水清洗2～3次以去除灰塵（至濾出液澄清即可）。濾渣濾干后放入裝有5L濃度分別為0%、1%、2%、3%、4%NaOH的容器中，在50℃水浴攪拌2h后，再在室溫（25℃）下攪拌過夜。用紗網(wǎng)過濾，并用自來水洗滌濾渣至pH=6～7（pH檢測(cè)中性），濾渣濾干后，放入裝有約5L水的容器中，高剪切乳化機(jī)11000r/min乳化20min后，紗網(wǎng)過濾，冷凍干燥，備用。

1.2.2 預(yù)處理后秸稈主要成分的檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的小麥秸稈300mg（精確至0.0001g）于研缽中，加入72%硫酸溶液3.5mL連續(xù)研磨2h，用100mL蒸餾水將研磨液轉(zhuǎn)移至250mL三角瓶中，100℃沸水浴煮沸2.5h，冷卻至室溫，加入適量BaCO3，充分?jǐn)嚢柚寥芤簆H為7左右，濾紙過濾，蒸餾水反復(fù)洗滌濾渣直至苯酚-硫酸法檢測(cè)無糖，濾液真空旋轉(zhuǎn)濃縮并定容至5mL，過0.22μm水膜，用HPLC檢測(cè)。色譜條件為：色譜柱：Sugar-D（4.6mm×250mm，5μm）；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈∶水（3∶1，v∶v）；流速：0.8mL/min；檢測(cè)溫度：30.0℃；進(jìn)樣體積：10μL。

分別以葡萄糖及木糖濃度（Y）為縱坐標(biāo)，峰面積（X）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖及木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1～圖2）。所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=10-5x+0.6346（r=1）；所得木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=10-5x+0.8224（r=0.9996）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 A linear standard curve of glucose

圖2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 A linear standard curve of xylose

纖維素及半纖維素根據(jù)以下公式[12]計(jì)算：纖維素含量=葡萄糖含量×0.9；半纖維素含量=木糖含量×0.88。

1.2.3 β-葡聚糖酶降解預(yù)處理小麥秸稈 準(zhǔn)確稱取1g（精確至0.0001g）預(yù)處理后小麥秸稈，加蒸餾水50mL，攪拌均勻，用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至4.8，攪拌升溫至50℃后，加入β-葡聚糖酶反應(yīng)2h，沸水滅活10min，冷卻，濾紙過濾，濾渣烘干后稱重，計(jì)算酶解轉(zhuǎn)化率（見下式），濾液濃縮定容，HPLC及熒光輔助糖電泳法（FACE）檢測(cè)酶解產(chǎn)物成分。

酶解轉(zhuǎn)化率（%）=（1－烘干后濾渣的重量）/1×100。

FACE檢測(cè)條件：?jiǎn)我痪酆隙壤w維寡糖經(jīng)熒光衍生16h，分離膠為35%丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為4%丙烯酰胺凝膠，正極緩沖液：（0.1mol/L Tris-HCl pH8.2），負(fù)極緩沖液：（0.15mol/L Tris-glycine pH8.5），400V電壓電泳1h后，1000V電泳到熒光前沿到達(dá)距離分離膠底部約1cm。

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥秸稈主要成分的含量測(cè)定及最佳堿處理濃度的選擇

2.1.1 HPLC檢測(cè)硫酸降解預(yù)處理小麥秸稈產(chǎn)物 堿預(yù)處理過的小麥秸稈經(jīng)過72%H2SO4降解后，HPLC檢測(cè)其主要產(chǎn)物見圖3。通過與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖4、圖5）比對(duì)，確定堿預(yù)處理過的小麥秸稈經(jīng)過72%H2SO4降解后主要產(chǎn)物為木糖和葡萄糖，因此，原小麥秸稈的主要纖維成分為纖維素和半纖維素。

2.1.2 最佳堿預(yù)處理濃度的選擇及酶解轉(zhuǎn)化率 經(jīng)不同濃度NaOH溶液預(yù)處理后的小麥秸稈纖維素及半纖維素含量、2h酶降解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率結(jié)果如表1所示。

圖3 經(jīng)72%H2SO4降解的堿預(yù)處理過小麥秸稈HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of pretreated wheat straw hydrolyzted with 72%H2SO4

圖4 木糖標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of xylose

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of glucose

由表1可以看出，經(jīng)不同濃度NaOH溶液處理后，小麥秸稈中纖維素、半纖維素含量及酶降解轉(zhuǎn)化率結(jié)果不同。由纖維素的含量可以看出，經(jīng)過NaOH預(yù)處理的小麥秸稈纖維素的含量高于不經(jīng)堿預(yù)處理的；從半纖維素的含量可以看出，NaOH濃度大于1%時(shí)，半纖維素保留量降低；經(jīng)1%NaOH溶液處理的小麥秸稈酶解2h轉(zhuǎn)化率為20.08%，高于其他三組。綜合考慮以上三個(gè)因素及堿濃度升高對(duì)后續(xù)處理帶來的不便，選擇小麥秸稈預(yù)處理的最佳NaOH濃度為1%。

表1 纖維素、半纖維素含量及酶解轉(zhuǎn)化率的比較Table 1 The cellulose,hemicellulose and enzymatic convertion rate of pretreated wheat straw

2.2 小麥秸稈主要酶降解產(chǎn)物分析

堿處理過的小麥秸稈經(jīng)β-葡聚糖酶降解后的HPLC測(cè)定結(jié)果如圖6所示。通過與纖維二糖標(biāo)準(zhǔn)品（圖7）及木糖、葡萄糖單糖標(biāo)準(zhǔn)品（圖4～圖5）對(duì)比，可以推測(cè)其主要的寡糖酶降解產(chǎn)物為纖維二糖。

圖6 β-葡聚糖酶降解堿處理小麥秸稈產(chǎn)物HPLC譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of pretreated wheat straw hydrolyzed with β-glucanase

圖7 纖維二糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of cellobiose

為了進(jìn)一步確定小麥秸稈酶降解產(chǎn)物的成分，對(duì)β-葡聚糖酶降解堿處理小麥秸稈的酶解液進(jìn)行熒光標(biāo)記并用熒光輔助糖電泳（FACE）檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，此酶解液中除主要含有纖維二糖外，還有多種其他的寡糖產(chǎn)物。

圖8 β-葡聚糖酶降解堿處理小麥秸稈產(chǎn)物的FACE譜圖Fig.8 FACE chromatogram of pretreated wheat straw hydrolyzed with β-glucanse

研究表明，纖維寡糖具有多項(xiàng)生理功能，是雙歧桿菌的增殖因子，能預(yù)防便秘，降低冠狀心臟疾病和癌癥的發(fā)病率，降低血清中膽固醇含量，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等功效[13-14]，可用于食品、飼料和保健、醫(yī)藥工業(yè)等，還可用于生物化學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域的研究，具有廣闊的市場(chǎng)前景[15]。國(guó)外學(xué)者證實(shí)口服纖維二糖不引起人體血糖水平變化，可以用作糖尿病患者的甜味劑[16]。

我國(guó)有豐富的纖維素資源，僅農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量就達(dá)6億多噸，但目前其利用率不到30%[17]，開發(fā)利用農(nóng)作物秸稈資源用于制備纖維類寡糖產(chǎn)品，為生物質(zhì)資源找到了新的出路，既能減少生物質(zhì)資源浪費(fèi)，又可以為纖維類寡糖的生產(chǎn)找到低價(jià)原料、降低生產(chǎn)成本，具有重要的研究意義。

然而，木質(zhì)纖維素組分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，未處理的木質(zhì)纖維素很難直接被酶降解，找到合適的木質(zhì)纖維素預(yù)處理?xiàng)l件，可以很大程度上提高其降解性能，在提高酶和秸稈原料的利用率、縮短反應(yīng)時(shí)間上都有重大意義。Chosdu等[18]采用電子束照射和2%NaOH相結(jié)合處理玉米秸稈等原料，酶解后葡萄糖得率顯著提高。MadsA等[19]研究了物理法預(yù)處理對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響，結(jié)果表明預(yù)處理改變了小麥秸稈結(jié)構(gòu)，可以提高酶對(duì)秸稈的降解效率。本研究用不同濃度的NaOH對(duì)經(jīng)粉碎過后的小麥秸稈進(jìn)行處理，對(duì)處理后的小麥秸稈中纖維素及半纖維素的保留量及其酶解轉(zhuǎn)化率進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)不同濃度NaOH對(duì)秸稈產(chǎn)生不同影響。經(jīng)過NaOH預(yù)處理的半纖維素含量不同程度的降低，但酶轉(zhuǎn)化率、可檢出纖維素含量均有所提高，證實(shí)了NaOH預(yù)處理對(duì)酶降解作用的必要性。

3 結(jié)論

本研究選擇不同濃度的NaOH溶液對(duì)粉碎后的小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理，確定了β-葡聚糖酶酶法降解小麥秸稈的最佳堿處理濃度為1%，β-葡聚糖酶水解小麥秸稈2h的轉(zhuǎn)化率約為20%；HPLC及FACE檢測(cè)其寡糖產(chǎn)物主要為纖維二糖。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了堿預(yù)處理對(duì)酶解反應(yīng)的必要性及β-葡聚糖酶降解小麥秸稈生成纖維寡糖產(chǎn)物的可行性；為小麥秸稈酶解制備纖維寡糖提供了研究依據(jù)。為了提高小麥秸稈的利用率及酶解效率，還需要進(jìn)一步對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化研究；對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以獲得酶解產(chǎn)物全部寡糖信息。

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