瑞舒伐他汀部分恢復(fù)嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效能

李永樂，謝軍明，舒銀銀，張 瑤，底 妍，孫 茜，劉 健，李偉彥

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院，2.南京軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，江蘇南京 210002)

長期應(yīng)用嗎啡可導(dǎo)致嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)的下降，出現(xiàn)嗎啡耐受現(xiàn)象。大量研究表明，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞在嗎啡耐受發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用［1－3］。最近研究發(fā)現(xiàn)［4］，他汀類藥物可調(diào)控脊髓膠質(zhì)細(xì)胞，治療神經(jīng)病理性疼痛。但其能否通過相似機(jī)制減輕嗎啡的耐受尚不清楚。因此，本研究觀察口服瑞舒伐他汀對已形成嗎啡耐受的大鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效能的作用，及腰段脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、ERK磷酸化的變化，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物選擇和分組 ♂ SD大鼠48只(由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分成6組，每組8只。Ⅰ組為空白對照組;Ⅱ組為嗎啡耐受組;Ⅲ組為10 mg·kg－1瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥)對照組;Ⅳ組為0.4 mg·kg－1瑞舒伐他汀處理組;Ⅴ組為2 mg·kg－1瑞舒伐他汀處理組;Ⅵ組為10 mg·kg－1瑞舒伐他汀處理組，瑞舒伐他汀的劑量參考既往文獻(xiàn)［4］。

1.2 慢性嗎啡耐受模型的建立 參照Raghavendra等［2］方法建立嗎啡耐受模型，每天8∶00和16∶00，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組皮下注射嗎啡10 mg·kg－1，連續(xù)5天;Ⅰ組和Ⅲ組每天同樣時間皮下注射等量的生理鹽水。模型建立后，6組繼續(xù)每天皮下注射嗎啡或生理鹽水至d 10。

1.3 給藥方案 d 6開始，Ⅰ、Ⅱ組在每天皮下注射前30 min給予生理鹽水灌胃，連續(xù)5 d;Ⅲ組在每天皮下注射前30 min給予10 mg·kg－1瑞舒伐他汀灌胃，連續(xù)5 d;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組在每天皮下注射嗎啡前30 min分別給予相應(yīng)劑量的瑞舒伐他汀灌胃，連續(xù)5 d。

1.4 行為學(xué)測試和MPE值計算 d 6和d 11給藥前，參照 Bianchi等［5］方法測定熱縮足潛伏期(PWTL)，最長照射時間為20 s，以防止組織灼傷。連續(xù)測定3次，每次間隔1 min，取平均值為基礎(chǔ)PWTL。測定基礎(chǔ)PWTL值后，從鼠尾靜脈注射嗎啡4 mg·kg－1，測定靜脈注射嗎啡后30 min每組大鼠的PWTL，取平均值記為鎮(zhèn)痛閾值。通過公式計算MPE=(鎮(zhèn)痛閾值–基礎(chǔ)閾值)/(最長照射時間－基礎(chǔ)閾值)。

1.5 免疫印跡法(Western blot) 取腰5脊髓，組織勻漿，離心取上清液，蛋白定量后，將40 μg總蛋白加入SDS上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性，經(jīng)SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液(5%脫脂牛奶)室溫封閉1 h，兔抗大鼠ERK和p-ERK一抗(1∶1 000，cell signaling technology)4℃孵育過夜，TBST清洗5 min×6次，羊抗兔二抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology)室溫孵育1 h，TBST清洗5 min×6次，暗室內(nèi)加顯色底物顯色曝光，掃描。內(nèi)參為GAPDH(1 ∶1 000，cell signaling technology)測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映ERK和p-ERK的表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光染色 取腰5脊髓，蔗糖溶液梯度脫水，將組織進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。5%的BSA封閉1 h，隨后加入GFAP抗體(1∶500，santa cruz biotechnology)，4℃孵育過夜，用 TBST洗3次后，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗(1∶300，santa cruz biotechnology)，室溫避光孵育2 h，漂洗3次。熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間均數(shù)總的比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測試 各組大鼠在靜脈注射嗎啡前基礎(chǔ)PWTL均無差異(Tab 1)。d 6，靜脈注射4 mg·kg－1嗎啡30 min后，與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組MPE值明顯降低(P＜0.05)，但Ⅲ組無差異。d 11，靜脈注射4 mg·kg－1嗎啡30min后，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅳ組大鼠的MPE值明顯降低(P＜0.05)，但Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ組則無差異。與Ⅱ組相比，Ⅴ以及Ⅵ組大鼠的MPE值均升高(P＜0.05)，但Ⅳ組則無差異(Fig 1)。

Tab 1 Basic paw withdraw latency of rats on day 6 and day 11

2.2 Western blot 各組大鼠腰5脊髓內(nèi)總ERK含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅳ組腰5脊髓內(nèi)p-ERK含量明顯升高(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組差異則無統(tǒng)計學(xué)意義;與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組腰5脊髓內(nèi)p-ERK含量明顯降低(P＜0.05)，Ⅳ組差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2)。

2.3 免疫熒光染色 免疫熒光染色的結(jié)果顯示，Ⅰ組和Ⅲ組大鼠腰5脊髓背角只有少量的GFAP表達(dá)，而Ⅱ組大鼠腰5脊髓背角GFAP表達(dá)明顯增加。與Ⅱ相比，Ⅵ組口服10 mg·kg－1瑞舒伐他汀后，腰5脊髓背角GFAP表達(dá)明顯減少(Fig 3)。

Fig 1 %MPE at 30min of rats on day 6 and day 11.

3 討論

大量的研究均發(fā)現(xiàn)長期使用嗎啡能引起脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化的膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子、趨化因子、一氧化氮等物質(zhì)，誘導(dǎo)和維持嗎啡耐受，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞在嗎啡耐受的維持中發(fā)揮著重要作用。通過使用多種膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑，如己酮可可堿、米諾環(huán)素、AV411等均能明顯緩解嗎啡耐受［6－8］。這充分說明了通過調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性是防治嗎啡耐受形成和發(fā)展的重要方向。

Fig 2 ERK and p-ERK expression in L5 spinal cord of rats.

近年來，他汀類藥物因其具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用而得到了越來越多的關(guān)注。Shi等［4］發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，緩解坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起的神經(jīng)病理性疼痛。Garcia等［9］發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以降低5種疼痛模型大鼠對疼痛刺激的敏感性，起到鎮(zhèn)痛作用，該效應(yīng)亦與其調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞，減輕炎效相關(guān)。因此，他汀類藥物可能成為防治嗎啡耐受的一種新選擇。

Fig 3 Expression of GFAP in L5 spinal cord was limited in group saline control group(A)and 10 mg·kg－1rosuvastatin control group(C)while that in morphine tolerance group(B)was increased significantly.The expression of GFAP in L5 spinal cord in 10 mg·kg－1rosuvastatin treatment group(D)was significant decreased compared with that in morphine tolerance group(B)

本研究參照Raghavendra等［1］方法建立嗎啡模型。d 6各組大鼠基礎(chǔ)PWTL并無明顯差異，說明連續(xù)5 d嗎啡皮下注射對大鼠基礎(chǔ)熱痛閾并無影響。但接受皮下注射嗎啡的大鼠d 6出現(xiàn)嗎啡鎮(zhèn)痛效能下降，這證明嗎啡耐受建模成功。連續(xù)5 d不同劑量的瑞舒伐他汀灌胃治療后，嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效能呈劑量依賴得到了恢復(fù)，說明瑞舒伐他汀能部分恢復(fù)了嗎啡耐受大鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效能。與生理鹽水對照組相比，d 6和d 11瑞舒伐他汀處理組基礎(chǔ)熱痛閾并無明顯變化，說明瑞舒伐他汀并無直接鎮(zhèn)痛作用，其作用是通過其它效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。為此，本研究觀察了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變，發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受的大鼠脊髓內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP免疫活性增強(qiáng)，10 mg·kg－1瑞舒伐他汀灌胃能有效地抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，說明瑞舒伐他汀的緩解嗎啡耐受的作用可能與其有效抑制腰段脊髓內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

ERK通路的激活在嗎啡耐受時脊髓星形細(xì)胞的活化的重要作用已被既往研究報道［10］。ERK是MAPK信號通道中的重要一員。大量的研究發(fā)現(xiàn)［11，12］，嗎啡耐受大鼠的不同腦區(qū)和脊髓中均有ERK的激活。Wang等［13］發(fā)現(xiàn)，ERK可通過影響降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的表達(dá)引起嗎啡耐受，后者已被證明是嗎啡耐受形成發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)各組大鼠總ERK并無明顯變化，但嗎啡耐受大鼠p-ERK含量較生理鹽水組大鼠明顯增高，而瑞舒伐他汀處理組大鼠p-ERK表達(dá)量呈劑量依賴地下降，這提示瑞舒伐他汀可能通過抑制脊髓內(nèi)ERK的磷酸化，從而抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

綜上所述，瑞舒伐他汀能呈劑量依賴地恢復(fù)嗎啡耐受大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛效能，該效應(yīng)可能與其有效抑制腰段脊髓內(nèi)ERK磷酸化、從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

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