去腎交感神經(jīng)術(shù)對(duì)高血壓大鼠左室肥厚及其炎癥因子的影響

譚麗華，李小剛，郭運(yùn)忠，唐曉鴻，楊 侃，蔣衛(wèi)紅

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院心內(nèi)科，湖南長沙 410013;2.湖南省馬王堆療養(yǎng)院心內(nèi)科，湖南長沙 410016）

左室肥厚是高血壓導(dǎo)致的常見靶器官損害之一，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進(jìn)與免疫炎癥反應(yīng)在左室肥厚發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［1-2］。左室肥厚是預(yù)測(cè)心腦血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3］，改善高血壓預(yù)后的研究重點(diǎn)在于逆轉(zhuǎn)左室肥厚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷腎交感神經(jīng)對(duì)慢性交感神經(jīng)過度激活引起的器官特異性損傷有積極作用［4-5］，Krum 等［6］在經(jīng)皮導(dǎo)管腎動(dòng)脈射頻消融治療頑固性高血壓患者的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，患者在術(shù)后血壓下降的同時(shí)伴隨左室質(zhì)量的減輕，提示去腎交感神經(jīng)治療可能延緩或逆轉(zhuǎn)高血壓靶器官損害，但其機(jī)制尚不清楚。本研究通過對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)行去腎交感神經(jīng)術(shù)，觀察其手術(shù)前后血壓、左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)及心肌局部Toll樣受體 4(Toll-like receptor 4，TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(inter leukin-6，IL-6)的變化，以探討去腎交感神經(jīng)術(shù)逆轉(zhuǎn)左室肥厚作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 SHR大鼠36只，同批同周齡WKY大鼠12只，體重240～280 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。兔抗鼠TLR4單克隆抗體和兔抗鼠NF-κB P65單克隆抗體均購自美國SantaCruz公司;兔抗鼠TNF-α多克隆抗體和兔抗鼠IL-6多克隆抗體則購自武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG購自美國Proteintech公司。

1.2 分組及處理 將36只SHR大鼠隨機(jī)分為SHR對(duì)照組、手術(shù)組和假手術(shù)組，每組12只;另取12只同批同周齡WKY大鼠作為WKY對(duì)照組。WKY對(duì)照組與SHR對(duì)照組、手術(shù)組與假手術(shù)組組間心率、體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組同條件喂養(yǎng)到12周齡時(shí)處死SHR對(duì)照組及WKY對(duì)照組大鼠，手術(shù)組及假手術(shù)組大鼠分別給予去腎交感神經(jīng)術(shù)及假手術(shù)處理后于術(shù)后1周、6周分批(每批各組6只)處死，均留取心臟組織標(biāo)本。

1.3 去腎交感神經(jīng)術(shù) 腹腔內(nèi)注射水合氯醛25mg/kg麻醉大鼠，沿腹白線，剪毛，消毒鋪巾，切開皮膚，逐層分離皮下組織及肌肉，暴露出腎臟，見輸尿管及包在鞘內(nèi)的動(dòng)、靜脈及神經(jīng)，剝離動(dòng)靜脈鞘，在解剖顯微鏡(×25)下找出所有腎神經(jīng)，切斷，并用棉球蘸溶于95%乙醇的10%苯酚溶液涂抹動(dòng)靜脈周圍;假手術(shù)組僅開腹，保留腎交感神經(jīng)僅用生理鹽水涂抹;隨后逐層縫合傷口，待大鼠自主蘇醒，術(shù)后第3天腹腔注射青霉素預(yù)防感染。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 血壓測(cè)量 應(yīng)用大鼠尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓測(cè)量儀測(cè)量，室溫下，將安靜狀態(tài)大鼠置于固定裝置，將尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓測(cè)量儀的尾部氣囊套入鼠尾近心端，脈搏換能器套入氣囊裝置內(nèi)，并緩慢加熱至39℃使鼠尾血管充分?jǐn)U張，另一端通過生理四通道信號(hào)采集儀連于電腦，待電腦收集信號(hào)穩(wěn)定后，充氣加壓，直到脈搏信號(hào)成為一條直線，然后逐漸放氣減壓，待脈搏信號(hào)出現(xiàn)規(guī)則波形時(shí)，電腦讀出血壓值，每只大鼠每3分鐘測(cè)1次，重復(fù)3次取均值。

1.4.2 LVMI計(jì)算 各組大鼠處死后留取心臟，沿房室交界處分離大血管、左右心房及右心室，用預(yù)冷的PBS液充分沖洗，濾紙吸干水份，稱量左心室(包括室間隔)的濕重，以左室重量與體重之比計(jì)算LVMI。

1.4.3 心肌組織 TLR4、TNF-α 及 IL-6 含量檢測(cè) SABC法常規(guī)進(jìn)行免疫組化染色:心肌組織常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟至水;滴加3%過氧化氫用以封阻內(nèi)源性過氧化物酶;置于pH 6.0的0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液80℃水浴(TNF-α或IL-6則需用95℃水浴修復(fù))熱修復(fù)20 min;PBS浸洗后滴加動(dòng)物血清封阻，室溫下孵育2h;滴加 TLR4或 TNF-α或IL-6一抗(均為1:100稀釋)濕盒中常溫孵育過夜;PBS浸洗后滴加二抗?jié)窈兄蟹跤? h;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素孵育2 h;DAB顯色，PBS終止，脫水透明、封片。

1.4.4 心肌組織 TLR4、NF-κB、TNF-α 及 IL-6蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 在檢測(cè)TLR4、TNF-α及IL-6時(shí)，取各組大鼠心肌組織勻漿后用RIPA組織細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白;檢測(cè)NF-κB時(shí)，用核蛋白提取試劑盒提取各組心肌細(xì)胞核蛋白，之后上述4個(gè)指標(biāo)均利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用TBST配制的5%脫脂奶粉封閉1 h后進(jìn)行一抗孵育，在封閉液中按1∶1000加入一抗(對(duì)應(yīng)的參照物均為β-actin)，緩慢搖動(dòng)4℃過夜，棄去一抗，TBS洗膜，加用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗(Proteintech，稀釋比例1∶3000)，緩慢搖動(dòng) 45 ～60 min，TBS 洗膜后ECL顯色曝光，顯影定影，拍照觀察膠片上的條帶，并分別用 Quantity One軟件分析 TLR4/βactin、NF-κB/β-actin、TNF-α/β-actin、IL-6/βactin的灰度比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓、舒張壓及LVMI的變化SHR對(duì)照組收縮壓、舒張壓及LVMI較 WKY對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)。腎交感神經(jīng)切除術(shù)1周后，手術(shù)組大鼠收縮壓、舒張壓、LVMI較SHR對(duì)照組及假手術(shù)組明顯降低(P＜0.05);手術(shù)后6周，手術(shù)組大鼠收縮壓、舒張壓與SHR對(duì)照組及假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但LVMI仍較假手術(shù)組降低(P＜0.05)，見表1。

2.2 各組心肌組織TLR4、TNF-α和IL-6表達(dá)變化 TLR4陽性表達(dá)主要位于心肌細(xì)胞胞膜及胞漿，呈棕黃色顆粒，在12周齡SHR大鼠心肌中即出現(xiàn)較多TLR4的陽性表達(dá)，1周假手術(shù)組TLR4陽性表達(dá)與SHR對(duì)照組相近，而去腎交感神經(jīng)術(shù)后1周手術(shù)組及6周手術(shù)組TLR4表達(dá)則均較相應(yīng)周齡的假手術(shù)組明顯減少;TNF-α及IL-6陽性表達(dá)主要位于胞漿，其在各組中的表達(dá)均與TLR4一致，見圖1。

表1 各組大鼠收縮壓、舒張壓及LVMI的變化Table 1 SBP，DBP and LVMI of SHR from each group

圖1 各組心肌組織TLR4、IL-6、TNF-α免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The myocardial expression of TLR4，IL-6，TNF-α in each group by immunohistochemical method

半定量檢測(cè)結(jié)果顯示，SHR組心肌TLR4、NF-κB、TNF-α 和IL-6的蛋白表達(dá)較WKY 對(duì)照組均升高(P＜0.05);術(shù)后1周SHR上述指標(biāo)較SHR對(duì)照及假手術(shù)組降低(P＜0.05);6周后，SHR 心肌 TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)仍低于假手術(shù)組(P＜0.05)，見表2、圖2。

3 討論

腎交感神經(jīng)系統(tǒng)慢性激活在高血壓及其靶器官損害的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腎交感神經(jīng)阻斷后可延緩高血壓的發(fā)生或降低血壓［7］。近年，去腎交感神經(jīng)治療已經(jīng)成為高血壓及其他慢性交感活性亢進(jìn)疾病如心力衰竭、高血壓合并糖耐量異常及慢性腎功能不全等的研究熱點(diǎn)［8-10］。Krum 等［6］發(fā)現(xiàn)，該治療方式不僅能有效降低血壓，對(duì)高血壓左室肥厚也有積極的影響，但其機(jī)制尚未闡明。本研究通過對(duì)SHR大鼠行去腎交感神經(jīng)術(shù)，術(shù)后1周發(fā)現(xiàn)SHR大鼠血壓及LVMI較假手術(shù)組均顯著降低，考慮此時(shí)壓力負(fù)荷的減輕可能是影響LVMI重要因素;然而在術(shù)后6周時(shí)手術(shù)組大鼠血壓回升，考慮可能與腎交感神經(jīng)存在部分再生有關(guān)，我們后續(xù)有關(guān)“腎胺酶在腎交感神經(jīng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠降壓機(jī)制的探討”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持這個(gè)假設(shè);而LVMI仍明顯低于假手術(shù)組，由此我們推測(cè)術(shù)后6周大鼠LVMI的改變可能還存在另外的影響因素。

表2 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)的半定量分析Table 2 The protein expression of TLR4，NF-κB，TNF-α，IL-6 detected by Western blot

圖2 各組大鼠心肌組織 TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression of TLR4，NF-κB，TNF-α，IL-6 detected by Western blot

許多研究認(rèn)為高血壓左室肥厚是一種低度慢性炎癥過程［11-12］，免疫炎癥機(jī)制在高血壓左室肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。目前研究認(rèn)為TLR4及其介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)途徑與高血壓左室肥厚的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它通過激活心肌中的原發(fā)免疫機(jī)制和炎癥反應(yīng)，參與了左室肥厚的形成和發(fā)展［13-15］。本研究發(fā)現(xiàn)12周齡SHR與同周齡WKY大鼠比較，已形成了高血壓，并出現(xiàn)了明顯的左室肥厚，且SHR隨著高血壓發(fā)病時(shí)間的延長，左室肥厚加重，同時(shí)伴有心肌 TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6 等免疫炎癥因子表達(dá)的增加，證實(shí)了免疫-炎癥反應(yīng)確實(shí)參與了SHR左室肥厚的發(fā)展。既往有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)與免疫炎癥反應(yīng)之間存在相互作用關(guān)系［16-17］，理論上認(rèn)為通過抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)活性可引起免疫炎癥反應(yīng)作用的減弱，從而達(dá)到改善左室肥厚的作用。本研究我們發(fā)現(xiàn)去腎交感神經(jīng)術(shù)后LVMI降低，而心肌局部炎癥因子 TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6 也呈降低趨勢(shì)，推測(cè)術(shù)后左室肥厚的改善可能與心肌局部免疫炎癥水平的改變有關(guān)。故結(jié)合以往實(shí)驗(yàn)的結(jié)果我們認(rèn)為去腎交感神經(jīng)術(shù)減輕SHR左室肥厚的作用除與壓力負(fù)荷的減輕有關(guān)外，可能也與心肌局部免疫炎癥通路作用的抑制有關(guān)。

綜上所述，由于交感神經(jīng)系統(tǒng)和免疫炎癥均參與了高血壓左室肥厚的發(fā)生發(fā)展，且兩者之間相互影響，共同促進(jìn)了左室肥厚的進(jìn)展，去腎交感神經(jīng)治療通過作用于上述兩種機(jī)制而對(duì)高血壓及其靶器官損害產(chǎn)生積極的影響，對(duì)改善高血壓患者的預(yù)后具有重要意義。但由于存在腎交感神經(jīng)再生或全身交感系統(tǒng)參與的反饋調(diào)節(jié)，該療法的長期安全性及有效性亟需更多循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)證實(shí)。

［1］DORN G W II.The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy ［J］.Hypertension，2007，49(5):962-970.

［2］SALLES G F，F(xiàn)ISZMAN R，CARDOSO C R，et al.Relation of left ventricular hypertrophy with systemic inflammation and endothelial damage in resistant hypertension［J］.Hypertension，2007，50(4):723-728.

［3］BOMBELLI M，F(xiàn)ACCHETTI R，CARUGO S，et al.Left ventricular hypertrophy increases cardiovascular risk independently of in-office and out-ofoffice blood pressure values［J］.J Hypertens，2009，27(12):2458-2464.

［4］DIBONA G F.Neural control of the kidney:past，present，and future ［J］.Hypertension，2003，41(3 Pt 2):621-624.

［5］DIBONA G F.Physiologyinperspective:The Wisdom of the body.Neural control of the kidney［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，289(3):R633-R641.

［6］KRUM H，SCHLAICH M，WHITBOURN R，et al.Catheter-based renal sympathetic denervation for resistanthypertension a multicentre safety and proof-of-principle cohort study ［J］.Lancet，2009，373(9671):1275-1281.

［7］WEINSTOCK M，GORODETSKY E，KALMAN R.Renal denervation prevents sodium retention and hypertension in salt-sensitive rabbits with genetic baroreflex impairment［J］.Clin Sci(Lond)，1996，90(4):287-293.

［8］KIMURA G，F(xiàn)UKUTA H.Catheter-based renal sympathetic denervation for treatment of hypertension ［J］.Nippon Naika Gakkai Zasshi，2011，100(2):441-445.

［9］MAHFOUD F，SCHLAICH M，KINDERMANN I，et al.Effectofrenalsympathetic denervation on glucose metabolism in patients with resistant hypertension:a pilot study［J］.Circulation，2011，123(18):1940-1946.

［10］PROCHNAU D，LAUTEN A，BUSCH M，et al.Catheter-based radiofrequency ablation therapy of the renalsympathetic-nerve system for drug resistant hypertension in a patient with end-stage renal disease［J］.Int J Cardiol，2011，5(12):234-239.

［11］KUWAHARA F，KAI H，TOKUDA K，et al.Hypertensive myocardialfibrosisand diastolic dysfunction.Another model of inflammation?［J］.Hypertension，2004，43(4):739-745.

［12］TSIOUFIS C，STOUGIANNOS P，KAKKAVAS A，etal.Relation ofleftventricularconcentric remodeling to levels of C-reactive protein and serum amyloid A in patients with essential hypertension［J］.Am J Cardiol，2005，96(2):252-256.

［13］FRANTZ S，KOBZIK L，KIM Y D，et al.Toll 4(TLR4)expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium ［J］.J Clin Invest，1999，104(3):271-280.

［14］ZHANG D，GAUSSIN V，TAFFET G E，et al.TAK1 is activated in the myocardium after pressure overload and is sufficient to provoke heart failure in transgenic mice［J］.Nat Med，2000，6(5):556-563.

［15］PURCELL N H，MOLKENTIN J D.Is nuclear factor-κB an attractive therapeutic targetfor treating cardiac hypertrophy ［J］.Circulation，2003，108(6):638-640.

［16］CHROUSOS G P.The stress response and immune function:Clinical implications［J］.Ann NY Acad Sci，2000，917:38-47.

［17］LEVICK S P，MURRAY D B，JANICKI J S，et al.Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart［J］.Hypertension，2010，55(2):270-276.