木犀草素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的促凋亡作用

王遠(yuǎn)鵬，周 亮，龔興國(guó)

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)所，浙江杭州 310058）

木犀草素(Luteolin)是一種天然多酚化合物，化學(xué)名為 3'，4'，5，7-四羥基黃酮，廣泛分布于竹、落花生、金銀花等植物中。已有研究表明，木犀草素具有抗感染、抗病毒、抗氧化等多項(xiàng)功能［1-3］。而木犀草素的抗腫瘤功能更是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，文獻(xiàn)報(bào)道木犀草素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有不同程度的抑制作用，其機(jī)制包括阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成以及敏化細(xì)胞凋亡等［4-7］。

活性氧(reactive oxygen species)是生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的高活性的含氧自由基或分子，廣泛存在于各類(lèi)細(xì)胞中，并在細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起重要作用?；钚匝跬ㄟ^(guò)細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種轉(zhuǎn)錄因子的水平與酶的活力，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因表達(dá)水平，最終導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)、衰老、凋亡［8］。近年來(lái)很多研究表明，細(xì)胞內(nèi)高活性的含氧自由基與癌細(xì)胞的發(fā)生有密切關(guān)系，癌細(xì)胞中的活性氧水平普遍高于普通細(xì)胞，這與腫瘤細(xì)胞受到外界的刺激、自身代謝率高以及線(xiàn)粒體失活有關(guān)［9］。高水平的活性氧會(huì)造成DNA損傷，促使基因突變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加快，對(duì)藥物耐受性增強(qiáng)。已有研究證實(shí)，一些化學(xué)藥物或抗氧化酶能通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的活性氧來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)［10-11］。因此從理論上講，作為一種有效的抗氧化劑，木犀草素能夠清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的活性氧，改變細(xì)胞的氧化狀態(tài)，調(diào)節(jié)某些細(xì)胞信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

本研究利用MTT法檢測(cè)了木犀草素對(duì)腫瘤細(xì)胞體外抗增殖作用，以FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用，同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了木犀草素作用下HepG2細(xì)胞氧化壓力的變化，并利用Western blot分析了木犀草素對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的影響，旨在為木犀草素在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 LO2人正常肝細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞、HL60白血病細(xì)胞、A549肺腺癌細(xì)胞等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

木犀草素由浙江工業(yè)大學(xué)提供，四甲基唑氮藍(lán)MTT、二甲基亞砜DMSO購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，NDA、DHE購(gòu)自英國(guó) Molecular Probe公司，胎牛血清與RPMI 1640培養(yǎng)液(含雙抗，Gibico原裝干粉配制，0.1 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，無(wú)支原體)購(gòu)于杭州四季青生物工程公司;胰蛋白酶(含0.5 mmol EDTA，Gibico原裝干粉配制)和PBS(Gibico原裝干粉配制)均購(gòu)于杭州吉諾生物技術(shù)公司;相關(guān)抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。其它試劑無(wú)特殊標(biāo)示均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

Bio-RAD Model 550 MICROPLATE READER酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Forma Scientific公司，倒置顯微鏡BDS200/200-PH購(gòu)于重慶奧特顯微鏡廠(chǎng)，T18 basic細(xì)胞破碎儀購(gòu)于德國(guó)IKA集團(tuán)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司，24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)sigma公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)使用包含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液置于飽和濕度下含5% 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。每日早晚兩次觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)培養(yǎng)液顏色逐漸變黃時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞瓶時(shí)，離心收集細(xì)胞，并按1∶2～1∶4的傳代比例接種與新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)木犀草素作用下各種腫瘤細(xì)胞與LO2細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。取1640培養(yǎng)液中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照1×105/ml的濃度接種到96孔板中(每孔接入100μl)，培養(yǎng)12 h。各孔中分別加入不同質(zhì)量濃度的木犀草素(2.5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，以 DMSO(未加藥)作用的細(xì)胞為對(duì)照，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，吸去孔中的培養(yǎng)液，加入MTT溶液(PBS 配置，0.5 mg/ml，100μl/孔)置于 37℃下避光孵育4 h。吸去溶液，每孔加入 150μl DMSO以溶解甲臜沉淀。使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔的吸光度值，并根據(jù)吸光度值計(jì)算腫瘤細(xì)胞的存活率(細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)吸光度值/對(duì)照吸光度值×100%)。同樣方法計(jì)算48 h和72 h的細(xì)胞存活率。

1.4 細(xì)胞氧化壓力測(cè)定 使用流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMeter，F(xiàn)CM)檢測(cè)木犀草素作用后HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化情況。將HepG2細(xì)胞稀釋重懸后接種到24孔板中(每孔接入100μl)，培養(yǎng) 12 h。加入梯度濃度(2.5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)的木犀草素，以 DMSO(未加藥)作用的細(xì)胞為對(duì)照，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)平行孔。藥物作用一定時(shí)間(6 h或12 h)后吸去培養(yǎng)液并洗去藥物，分別加入DHE(檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平)至終濃度為10 μmol/L，置于37℃避光孵育30 min。離心收集細(xì)胞并重懸于PBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。其中激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，DHR的發(fā)射波長(zhǎng)為564～606 nm。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)木犀草素作用下HepG2細(xì)胞的凋亡情況。將腫瘤細(xì)胞按照1×105/ml的濃度接種到96孔板中(每孔接入100μl)，培養(yǎng)12 h后加入梯度質(zhì)量濃度的木犀草素(2.5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，以 DMSO(未加藥)作用的細(xì)胞為對(duì)照，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)平行孔。藥物作用24 h后用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，用結(jié)合液重懸細(xì)胞并加入Annexin V–FITC避光孵育10 min，離心沉淀細(xì)胞后用結(jié)合液重懸，并加入PI冰上避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 相關(guān)信號(hào)通路蛋白分析 利用Western blot分析木犀草素作用下HepG2細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。以對(duì)β-actin蛋白的分析為例，將HepG2細(xì)胞稀釋重懸后接種到6孔板中(每孔接入1 ml)，培養(yǎng)12 h。各孔中分別加入不同質(zhì)量濃度的木犀草素(2.5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，以 DMSO(未加藥)作用的細(xì)胞為對(duì)照，每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。作用6 h后收集處理細(xì)胞，通過(guò)Western blot分析相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，其中actin抗體稀釋比例為1∶3000，p53 抗體稀釋比例為1∶3000，ASPP2抗體稀釋比例為1∶3000，iASPP抗體稀釋比例為1∶3000。并以同樣方法檢測(cè)藥物作用梯度時(shí)間后相關(guān)蛋白的變化。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

在木犀草素作用24 h、48 h、72 h時(shí)，HepG2細(xì)胞的 50%抑制濃度(IC50)分別為 25.62μg/ml、18.43μg/ml、9.06μg/ml，A549 細(xì)胞的 IC50分別為 30.60μg/ml、21.39μg/ml、9.59μg/ml，HL60 細(xì) 胞 的 IC50分 別 為 60.12μg/ml、23.32μg/ml、15.75μg/ml，而 LO2 細(xì)胞相應(yīng)的IC50分別為 119.7μg/ml、68.86μg/ml、62.47μg/ml。經(jīng)單因素方差分析，所有抑制作用均具有濃度依賴(lài)性(HepG2、A549、HL60、LO2 趨勢(shì)檢 驗(yàn) F 值 分 別 為 109.1、327.7、397.7、90.37，均 P ＜ 0.01)與時(shí)間依賴(lài)性(HepG2、A549、HL60、LO2 趨勢(shì)檢驗(yàn) F 值分別為 72.35、110.3、213.4、316.9，均 P ＜0.0001)，如圖 1 所示。提示木犀草素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)對(duì)LO2細(xì)胞也具有輕微毒性。本研究選取HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 木犀草素對(duì)腫瘤細(xì)胞氧化壓力的影響

圖1 木犀草素對(duì)3種腫瘤細(xì)胞及LO2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 The inhibition of luteolin to 3 cancer cells and LO2 cells

木犀草素作用6 h、12 h時(shí)，HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧水平均隨著藥物濃度的增加而下降，且兩者均具有濃度依賴(lài)性(6 h、12 h趨勢(shì)檢驗(yàn)F值分別為35.76、396.3，均 P ＜0.0001)，見(jiàn)圖 2。其中，20μg/ml藥物作用12 h后，活性氧水平降低了(41.11±0.92)%，與相同作用時(shí)間下10μg/ml藥物相比無(wú)明顯變化(Tukey檢驗(yàn)，P＞0.05)。提示木犀草素濃度達(dá)到一定水平后，細(xì)胞內(nèi)氧化壓力達(dá)到平衡狀態(tài)。對(duì)藥物作用6 h后活性氧水平的變化與相應(yīng)濃度作用下HepG2細(xì)胞存活率進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者明顯正相關(guān)(r=0.985，P=0.015)。

2.3 木犀草素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用 木犀草素作用HepG2細(xì)胞24 h后，隨著木犀草素濃度的增加，凋亡早期細(xì)胞(Annexin V+/PI-)和壞死細(xì)胞(Annexin V+/PI+)比例上升，且兩者均具有濃度依賴(lài)性(F值分別為 58.17、47.96，P ＜0.0001);20μg/ml藥物作用 HepG2細(xì)胞24 h后，凋亡和壞死的細(xì)胞比例總計(jì)達(dá)到(14.43 ±1.66)%，見(jiàn)圖3。提示木犀草素能夠有效誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

2.4 木犀草素對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的影響

圖2 木犀草素作用后HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧變化Fig.2 The change of ROS in HepG2 after treatment with luteolin

圖3 木犀草素作用24 h后HepG2細(xì)胞凋亡比例Fig.3 The rate of apoptotic HepG2 after treatment with luteolin for 24 h

在不同濃度木犀草素作用下，ASPP家族蛋白表達(dá)量變化如圖4、表1所示，木犀草素不同作用時(shí)間后ASPP家族蛋白表達(dá)變化則如表2、圖5所示。木犀草素能夠降低HepG2細(xì)胞內(nèi)的iASPP水平，并上調(diào)p53與ASPP2水平;所有相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化均具有明顯的劑量依賴(lài)性(p53、ASPP2、iASPP表達(dá)量趨勢(shì)性檢驗(yàn)F值分別為 52.37、25.92、13.31，P ＜ 0.01)和時(shí)間依賴(lài)性(p53、ASPP2、iASPP表達(dá)量趨勢(shì)性檢驗(yàn)F 值分別為 8.37、11.29、19.87，P ＜0.01)。對(duì)ASPP家族蛋白表達(dá)水平分別與相應(yīng)濃度藥物作用下的HepG2細(xì)胞存活率以及細(xì)胞凋亡壞死率進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)p53、ASPP2、iASPP表達(dá)量與細(xì)胞存活率相關(guān)系數(shù)分別為-0.995、-0.992、0.902，與細(xì)胞凋亡壞死率相關(guān)系數(shù)分別為 0.931、0.928、-0.983，均 P ＜ 0.01，提示木犀草素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用與其對(duì)ASPP家族蛋白表達(dá)水平的調(diào)控有關(guān)。

表1 藥物不同濃度作用下相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 1 Dose response of the relative expression for related pathway proteins

表2 藥物不同作用時(shí)間后相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Time response of the relative expression for related pathway proteins

3 討論

腫瘤細(xì)胞由于受到外界的刺激、自身代謝率高以及線(xiàn)粒體失活等原因，其細(xì)胞內(nèi)活性氧水平普遍高于普通細(xì)胞。高濃度的活性氧增強(qiáng)了其對(duì)藥物的耐受性，也是腫瘤細(xì)胞具有異常生長(zhǎng)能力的原因之一。有研究猜測(cè)細(xì)胞內(nèi)可能存在一個(gè)確保細(xì)胞基本功能的活性氧水平底限，在正常細(xì)胞中活性氧只微微高于這一水平;而腫瘤細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這一水平［12］。同時(shí)有報(bào)道表明活性氧能夠與某些細(xì)胞因子相互作用，從而參與一些信號(hào)傳遞過(guò)程，如 NF-κB、p53、JNK、Akt等［13］。因此，通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的活性氧來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)也成為腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道木犀草素抗腫瘤細(xì)胞增殖、促腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，此前研究指出木犀草素可以抑制蛋白激酶 C的活性［14］，激活 JNK信號(hào)通路［15］，對(duì) MAPK/ERKS 和 PI3K-Akt信號(hào)通路也有影響［16］。在本研究中，我們驗(yàn)證了木犀草素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有濃度依賴(lài)的抑制作用，同時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的檢測(cè)結(jié)果表明其活性氧水平明顯下降，相關(guān)性分析表明木犀草素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用可能與其能清除胞內(nèi)過(guò)量的活性氧有關(guān)［17］。

而藥物阻滯腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)很有可能也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們通過(guò)annexin VFITC/PI雙染法對(duì)木犀草素作用后的HepG2細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明處于凋亡早期的細(xì)胞比例顯著上升(具有濃度依賴(lài)性)，證明木犀草素能夠有效誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的變化與p53通路相關(guān)的細(xì)胞程序性死亡有密切關(guān)系;此前也有報(bào)道顯示木犀草素能夠阻滯HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)周期［4］，并抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)的Akt磷酸化［14］，而細(xì)胞周期阻滯、Akt通路與p53之間關(guān)系也非常密切。p53可以抑制Akt的活化;Akt則可以通過(guò)穩(wěn)定Mdm2促進(jìn)p53的降解，兩者通過(guò)這樣的方式互相抑制。而對(duì)ASPP家族蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析也說(shuō)明木犀草素促腫瘤細(xì)胞凋亡的功能很有可能與p53通路有關(guān)。

p53基因是一種與人類(lèi)腫瘤高度相關(guān)的基因，目前在75%的惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。p53蛋白如果發(fā)生突變則可能成為一種腫瘤促進(jìn)因子，引起腫瘤的形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化;野生型p53蛋白有抑制腫瘤發(fā)生的功能，當(dāng)細(xì)胞的DNA因外界因素受到損傷時(shí)，P53蛋白就會(huì)通過(guò)一系列途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，將細(xì)胞周期阻滯在G1期以促使細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)，如果修復(fù)失敗則觸發(fā)細(xì)胞凋亡［4］。而ASPP家族(Ankyrin repeat，SH3 domain and proline-rich domain protein)即p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of p53 family)，是近幾年新發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞凋亡的蛋白家族，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。其包括具有相似結(jié)構(gòu)的三個(gè)成員:ASPP1、ASPP2與iASPP。ASPP家族蛋白通過(guò)與p53結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能，其中ASPP1和 ASPP2與p53結(jié)合后提高p53反應(yīng)的原凋亡基因活力，促進(jìn)p53蛋白依賴(lài)的細(xì)胞凋亡;而iASPP則競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合p53而抑制細(xì)胞的凋亡［18］。當(dāng)細(xì)胞DNA受損時(shí)，ASPP蛋白家族不同成員與P53蛋白的特異性結(jié)合將決定細(xì)胞是分裂停滯還是走向凋亡［19］。因此，ASPP基因家族在p53凋亡通路中起著重要的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以降低HepG2細(xì)胞內(nèi)iASPP水平，同時(shí)升高p53與ASPP2等促凋亡蛋白水平。因此我們推測(cè)在木犀草素的作用下，HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降，從而抑制腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體活性，同時(shí)木犀草素提高了p53與ASPP2蛋白水平，抑制iASPP表達(dá)，促進(jìn)p53蛋白依賴(lài)的細(xì)胞凋亡。然而木犀草素對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制尚不明確;此外木犀草素是如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平的并最終影響細(xì)胞命運(yùn)的?藥物又是如何進(jìn)入細(xì)胞的?是直接與活性氧反應(yīng)還是與其他信號(hào)分子反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)?這些疑問(wèn)都需要進(jìn)一步研究才能明確其中的作用途徑和機(jī)制。希望未來(lái)對(duì)木犀草素調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)通路蛋白的分子機(jī)制、其他抗腫瘤作用靶點(diǎn)、以及與其他藥物聯(lián)用的效果研究能為臨床用藥提供新的數(shù)據(jù)支持。

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