子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)研究

王利公，楊新園，王 偉

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1.檢驗科;2.婦產(chǎn)科;3.麻醉科，陜西西安 710061）

人子宮內(nèi)膜由腺上皮細胞、間質(zhì)細胞和血管組成，近年越來越多的研究表明，子宮內(nèi)膜組織中存在一小群具有強大增殖和多向分化潛能的干細胞，可不斷分裂增殖，及時補充脫落的終末分化細胞，使子宮內(nèi)膜始終保持自我更新和再生能力?，F(xiàn)代婦產(chǎn)科學(xué)研究向細胞、亞細胞及分子水平發(fā)展，在體外成功的培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細胞可為研究細胞的生長分化、代謝以及激素作用機制提供一個理想的實驗?zāi)Ｐ?。本實驗旨在分離、純化子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞，即基質(zhì)干細胞，觀察細胞形態(tài)并分析其生長特點，建立子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)模型，為探索其臨床應(yīng)用價值提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司;膠原酶Ⅲ、免疫磁珠(CD45、EpCAM)、胰島素、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、轉(zhuǎn)化生長因子β1均購自Sigma公司;胰蛋白酶等購自 Gibco公司;CD105、CD90、CD45、CD34、OCT-4單克隆抗體以及 Vimentin抗體均購自Becton Dickinson公司。

1.2 標本 留取10例子宮內(nèi)膜標本，患者年齡32～43歲，因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)，手術(shù)前3個月未服用激素類藥物，組織學(xué)診斷未發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜有病理性改變。標本均經(jīng)本人及家屬知情同意后獲得。在無菌條件下取內(nèi)膜全層+子宮肌層5 mm，取材遠離病變部位，放入冰浴DMEM/F-12/5%NCS培養(yǎng)液中，低溫條件下迅速轉(zhuǎn)移到實驗室進行分離培養(yǎng)。

1.3 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下PBS沖洗3次，小心刮取子宮內(nèi)膜，剪碎約1 mm3的小塊，加入膠原酶Ⅲ(300μg/ml)+DNA酶I(40μg/ml)，置37℃恒溫水浴搖床(150 r/min)消化，，大約45～60 min后，加入DMEM/F-12/5%NCS終止消化，用40 μm濾網(wǎng)過濾，收集濾液。用抗人CD45單抗免疫磁珠分離細胞。調(diào)整細胞濃度為1×108/ml，取細胞懸液80μl加入標記有EpCAM抗體的免疫磁珠20μl，混勻后置于4℃冰箱中15 min。加2 ml PBS，300 r/min 離心 10 min，小心吸去上清，用500μl PBS重懸細胞。將分離儀上分離得到的EpCAM-的基質(zhì)細胞加入培養(yǎng)液，置于37℃，體積分數(shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液。

在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞，達80%融合時吸除培養(yǎng)基，PBS輕洗3次，95%酒精室溫固定10 min，PBS輕洗細胞3次;0.25%TritonX-100打孔，3%過氧化氫溶液浸泡10 min，PBS洗3次。滴入5%羊血清，室溫10 min吸棄孔上的羊血清，直接加入已稀釋的一抗Vimentin(1∶100稀釋)4℃過夜，將一抗吸棄并用PBS洗5次;加入已稀釋的二抗后放入37℃恒溫箱中30 min，PBS洗5次;加入SP后放30 min，用PBS洗5次，加入DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。將分離的基質(zhì)細胞進一步行克隆形成實驗。將細胞低密度接種于60 mm培養(yǎng)皿上，接種密度為300～500細胞/cm2，6～7 d換液1次。培養(yǎng)15 d后選取形成的大克隆，克隆環(huán)獲取，將獲得的子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.4 檢測細胞表面標志物 取第3代細胞，將1×106個細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，用PBS洗滌離心2次，棄上清，加入PBS重懸，分別取100μl PBS加入流式管中，1 號為空白對照，2、3、4、5號分別加稀釋倍數(shù)為 1∶30的 CD34-PE、CD105-FITC、CD45-PE和 CD90-PE mAb工作液100μl，混勻后置37℃溫箱中孵育30 min。每管加1 ml PBS混勻，1000 r/min離心10 min，棄去上清。分別加500μl PBS，上機檢測;對照組未加入抗體。

1.5 細胞周期測定 取第3代細胞1×106個細胞離心后棄上清，加入700μl無水冰乙醇混勻，3 ～5 min 后加入300μl PBS 混勻，4℃保存4 h后送檢。1500 r/min離心5 min，沉淀加Trton X-100 約140μl，孵育15 ～20 min，加碘化丙啶約2 ml，孵育15～20 min，上機檢測。

1.6 細胞倍增時間測定 取第3代處于對數(shù)生長期的細胞，消化后制備成單細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×107/L，取11塊96孔板，每板設(shè)6 個復(fù)孔，1 個對照孔，100μl/孔，即1000個細胞/孔，對照孔無細胞，僅加培養(yǎng)基。置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。從次日始，每天同一時間取一塊96孔板，每孔加入5 g/L MTT 10μl，4 h后小心吸出孔內(nèi)液體，注意防止吸出結(jié)晶，加入100μl三聯(lián)液(100 g/L十二烷基硫酸鈉、體積分數(shù)為5%的異丁醇、0.012 mol/L鹽酸)，12 h后在酶標儀上選用570 nm、490 nm波長測定各孔吸光度值。取均值，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線，計算倍增時間。細胞倍增時間計算公式:Td=△t×Ig2/IgAt2-IgAt1。

1.7 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞的成脂和成骨的誘導(dǎo)分化 取第3代內(nèi)膜基質(zhì)干細胞1×105/cm接種于24孔板，待80%融合時，吸去完全培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液［1］［DMEM/F-12/10%NCS基礎(chǔ)培養(yǎng)液、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)0.5 mmol/L、胰島素 2 μmol/L、地塞米松1 ×10-7mol/L、吲哚美辛200 μmol/L］，進行成脂肪細胞誘導(dǎo)分化3周，每3天進行半量換液。成脂誘導(dǎo)3周的細胞，觀察到胞質(zhì)中有空泡形成時，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定15 min，以0.375%油紅O染色15 min，蘇木精復(fù)染2～5 min，顯微鏡下觀察、照相。分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后21 d行RT-PCR測定過氧化酶活化增生受體 γ(抗原)(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、瘦素(leptin，LEP)的表達情況。

取第3代內(nèi)膜基質(zhì)干細胞1×105/cm接種于24孔板，待80%融合時，吸去完全培養(yǎng)基，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液［1-3］(DMEM/F-12/10%NCS基礎(chǔ)培養(yǎng)液、地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸50 mg/L)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3周，每72 h換液1次。成骨誘導(dǎo)3周的細胞采用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入1%茜素紅溶液，37℃染色30 min，蒸餾水洗去多余染料，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢。分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后21 d行RTPCR測定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin)的表達情況。

RT-PCR方法RNA提取:棄去各組細胞的培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，每瓶加入Trizol l ml充分吹打溶解細胞;將細胞溶解液轉(zhuǎn)入 EP管中，室溫放置5 min;按0.2 ml/ml的容積比加入氯仿 0.2 ml，劇烈振蕩 30 s，室溫放置 10 min，12000 r/min 4℃離心5 min;將上清液轉(zhuǎn)移至另一 EP管中，加入異丙醇0.5 ml，顛倒混勻數(shù)次，室溫放置 5 min，12000 r/min 4℃ 離心 5 min;棄上清，加入75%的冷乙醇洗滌2次，慢慢旋轉(zhuǎn)EP管洗滌沉淀，12000 r/min室溫離心2 min;吸干殘余液體，空氣干燥15 min;向沉淀中加入50μl DEPC水，輕輕振蕩混勻;將提取的RNA用紫外分光光度計測定OD值及OD 260/OD 280比值，計算 RNA濃度。樣品進行RT-PCR。RNA濃度測定后，所提RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，先制膠后電泳，c-DNA制備。反應(yīng)條件:42℃，10 min→30℃，20 min→99℃，5 min→4℃，5 min。按引物設(shè)計原則設(shè)計引物，由Invitrogen公司合成，具體見表1。電泳:取PCR產(chǎn)物4μl上樣，同時在另一點樣孔中加100 bp DNA Ladder 3μl。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，所用電泳緩沖液為1.5×TBE，電壓5 V/cm。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀下觀察并拍照。

表1 脂肪細胞和骨細胞特異性基因引物序列和長度Table 1 Human endometrial stromal stem cells differentiation induction gene name and primer sequences for PCR amplification

1.8 OCT-4檢測 在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞，達80%融合時棄去上清，40 g/L多聚甲醛固定，15 min，PBS沖洗3次，加入3%BSA封閉30 min，阻斷非特異性染色的產(chǎn)生，加入BSA稀釋的一抗OCT-4，4℃過夜，PBS沖洗3次，10 min/次，加二抗，室溫作用1 h，PBS沖洗3次，DAB顯色，顯微鏡下拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng) 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞多呈梭形、不規(guī)則三角形，核為卵圓形位于靠近細胞質(zhì)的中央，細胞排列成漩渦狀、放射狀、或似柵欄狀生長;Vimentin染色陽性(圖1)。將細胞低密度接種培養(yǎng)板后，形成散在分布的集落，包含2種克隆(圖2):小克隆數(shù)目多，由一些低核質(zhì)比例，疏松連接的大細胞組成，這些細胞是一些較成熟的短暫擴充細胞，排列松散;大克隆數(shù)目少，其中含有高核質(zhì)比例的小細胞＞4000個，緊密聚集而成，這些細胞被認為是子宮內(nèi)膜干細胞［4］。

2.2 基質(zhì)干細胞表型特征鑒定 細胞表面抗原表達類似于骨髓間充質(zhì)干細胞，均表達典型的間充質(zhì)干細胞表面抗原 CD105、CD90，不表達造血干細胞表面抗原CD34、CD45(圖3)。

2.3 細胞周期測定 流式細胞儀檢測結(jié)果表明，發(fā)生DNA復(fù)制的S期和G2-M期細胞比例高，意味著此細胞群中發(fā)生有絲分裂的細胞較多，因而增殖能力較強(圖4)。

圖1 原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Observation of morphological feature of primary cultured endometrialstromal cells

2.4 基質(zhì)干細胞增殖活性測定 傳代后第1～3天細胞增殖較慢，第4天開始細胞進入快速增殖期，第6天進入平臺期，根據(jù)吸光度值繪制細胞生長曲線呈“S”形，有明顯的滯留期、對數(shù)生長期和平臺期。在細胞生長的對數(shù)期，細胞倍增時間為68 h(圖5)。

2.5 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察及成脂基因表達 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d，倒置顯微鏡觀察細胞由梭形變?yōu)閳A形或多角，體積增大，細胞呈多極突起，且突起細長，小部分細胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)很小的折光性很強的脂滴，主要位于核周。誘導(dǎo)后10 d，部分細胞脂滴增多，有的脂滴聚集成較大的脂泡，脂肪細胞呈灶狀分布。誘導(dǎo)后14 d，絕大部分細胞已變成脂肪細胞，細胞多呈圓形或橢圓形，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴。誘導(dǎo)后21 d，油紅O染色鑒定脂肪細胞中含大小不等的脂肪滴，脂滴被染成橙紅色，細胞核為藍色(圖6-A)。RT-PCR測定顯示誘導(dǎo)第21天PPARγ、LEP mRNA條帶均呈陽性表達，未誘導(dǎo)組僅表達內(nèi)參，PPARγ、LEP mRNA條帶表達陰性(圖6-A)。

圖2 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的克隆培養(yǎng)Fig.2 Colonies formed by human endometrial stromalcellsseeded atthe clonal density and cultured for 15 days

2.6 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察及成骨基因表達 經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，細胞呈多中心、放射狀排列，位于中心的細胞體積增大，而周圍細胞仍呈長梭形狀。誘導(dǎo)后7 d，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槁褕A形或多角形，細胞形態(tài)均一，體積明顯增大，細胞質(zhì)豐富，細胞器發(fā)達，細胞外基質(zhì)分泌增多，細胞核增大，胞核顏色較淡。誘導(dǎo)21 d，細胞生長密集，中央可見類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu)，部分細胞呈現(xiàn)層疊樣生長。茜素紅染色后鏡下可見細胞密集處有紅色的沉著物，呈團樣并向四周放射，中心顏色明顯加深可見染成紅色的鈣結(jié)節(jié)(圖6-B)。RT-PCR測定顯示誘導(dǎo)第21天ALP、骨鈣素mRNA條帶均呈陽性表達，未誘導(dǎo)組僅表達內(nèi)參，ALP、骨鈣素mRNA條帶表達陰性(圖6-B)。

圖3 流式細胞儀鑒定基質(zhì)干細胞表面標記Fig.3 Flow cytometric analysis of cell surface markers

2.7 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞OCT-4的表達情況

免疫細胞化學(xué)染色證實子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞OCT-4表達陽性(圖7)。

3 討論

干細胞理論在越來越多的研究中得到證實，但是由于成體干細胞在組織中數(shù)目極少［5-7］，限制了干細胞的研究工作，因而有必要建立一種子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞的富集純化方法，以解決子宮內(nèi)膜干細胞研究中由于干細胞數(shù)量極少所致的瓶頸問題。以往，子宮內(nèi)膜組織中干細胞分離方法相對粗糙，難以去除混雜的細胞。基質(zhì)細胞培養(yǎng)時細胞成分復(fù)雜，主要存在2種形態(tài)的貼壁細胞:梭形成纖維樣細胞和大的圓形細胞。大部分標本中纖維樣細胞占優(yōu)勢，基質(zhì)干細胞夾雜其間很難分離。經(jīng)典的干細胞分離方法是通過免疫磁珠法分選，但子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞純度不理想。本研究將免疫磁珠法和克隆形成實驗結(jié)合純化基質(zhì)干細胞［4，8］，再將純化獲取的大克隆細胞傳代培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。在培養(yǎng)過程中，我們還注意到以下幾個環(huán)節(jié):①目前國內(nèi)外對原代子宮內(nèi)膜細胞的分離培養(yǎng)方法并不一致，大多數(shù)選用Ⅲ型膠原酶消化分離原代細胞，但也有使用I型膠原酶，或聯(lián)合應(yīng)用胰酶，甚至僅用胰酶進行消化分離的報道。實驗經(jīng)過摸索，使用300μg/ml的膠原酶Ⅲ攪拌消化，使子宮內(nèi)膜組織和消化液充分混合，提高了消化效率，在較短的時間內(nèi)取得了滿意的消化效果，細胞獲取量大，收集的原代活細胞多，且分離方法簡便。②原代培養(yǎng)首次換液的時間宜在2～3 d，過早換液將丟失過多尚未貼壁細胞，實驗過程中，第1天首次換液后，收集舊培養(yǎng)液離心洗滌，再接種仍有細胞生長;且原代細胞在培養(yǎng)4～5 d達到80%以上的融合才能傳代成功，這可能與我們用的培養(yǎng)基中所加的胎牛血清濃度不同有關(guān)。③培養(yǎng)基中胎牛血清濃度保持在10% 左右為宜，過低由于缺乏生長因子刺激，細胞增殖較慢;而過高因含大量促進細胞生長增殖分化的因子，易引起細胞過早老化;④胰蛋白酶消化細胞時，可先將PBS潤洗培養(yǎng)瓶2次，去除殘留血清，更易將貼壁細胞消化下來，且消化時間縮短，不會因消化時間過長而對細胞造成損傷;⑤細胞傳代時，注意接種密度，宜按1∶2比例傳代，如此細胞才能保持良好的增長趨勢，不會因接種密度過稀而致增長緩慢。

圖6 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞多向分化能力檢測Fig.6 In vitro differentiation of human endometrial stromal stem cells

圖7 子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞OCT-4表達陽性(×200)Fig.7 Attached OCT-4 positive human endometrial stroma stem cell(×200)

子宮內(nèi)膜干細胞目前缺乏特異性的表面標志［9］，對它的識別是通過其細胞形態(tài)特征、增殖特點、干細胞特征性表面標志物及其功能性特征來綜合分析。子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞屬于間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，2005年國際細胞治療協(xié)會(the International Society for Cellular Therapy，ISCT)定義了 MSCs的標準:首先，MSCs在標準培養(yǎng)條件下必須具備貼壁生長的特點;其次，MSCs表達 CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79a、CD19 表面分子表達陰性;第三，MSC在體外能分化為格根包爾氏細胞、脂肪細胞和成骨細胞。本實驗在細胞培養(yǎng)過程中，通過倒置顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞多呈梭形、不規(guī)則三角形，核為卵圓形位于靠近細質(zhì)的中央，與骨髓間充質(zhì)干細胞一樣具有貼壁生長成纖維細胞樣外觀的體外生物學(xué)特征［10-11］，Vimentin染色陽性，表明是基質(zhì)細胞。盡管缺乏特異性的表面標志，但其表面標志物的檢測對于干細胞的鑒定仍起著非常重要的篩選和鑒別排除作用。本實驗流式細胞儀檢測表面抗原顯示，CD90、CD105表達陽性，不表達造血系標志CD34、CD45，表明獲得的細胞為非造血類的、符合間充質(zhì)干細胞的特點。

增殖能力是干細胞的一個重要的生物學(xué)特性，是選擇組織工程種子細胞的一個重要考慮因素。測定生長曲線是觀察細胞增殖生長基本規(guī)律的重要方法。從子宮內(nèi)膜組織中分離培養(yǎng)的原代細胞接種后先經(jīng)過4～5 d的生長遲緩期，然后進入增殖期，細胞在48 h內(nèi)達到融合。而傳代培養(yǎng)的干細胞潛伏期為3 d，第4天開始細胞進入快速增殖期，第6天進入平臺期，實驗結(jié)果的差異可能與細胞來源、接種密度、所用培養(yǎng)基和傳代數(shù)有關(guān)。干細胞通過細胞周期分裂增殖，發(fā)生DNA復(fù)制的S期和G2-M期細胞比例高意味著此細胞群中發(fā)生有絲分裂的細胞較多，因而增殖能力較強。為進一步確認本實驗所得細胞具有干細胞特性，采用成脂誘導(dǎo)劑(地塞米松、胰島素、吲哚美辛和IBMX)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)劑(地塞米松;β-甘油磷酸鈉;抗壞血酸)［1-3］誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)特殊染色，RT-PCR 檢測到LEP、PPARγ等脂肪細胞特異表達基因及成骨細胞特異表達基因骨鈣素、ALP，證實子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞具有向成脂、成骨方向分化的潛能［10］。子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞的多向分化能力是在特定誘導(dǎo)條件下，這些細胞發(fā)生增殖、誘導(dǎo)并啟動與細胞表型相關(guān)的特異性基因表達，因此，這些細胞朝著自己終末細胞方向分化。地塞米松對成脂、成骨分化具有雙重作用，它依賴于使用劑量及作用時間等［12］。本實驗應(yīng)用低濃度(10-8mol/L)地塞米松配合抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞表達ALP，3周后形成鈣化結(jié)節(jié);而較高濃度(10-7mol/L)的地塞米松與胰島素共同作用激活細胞表面糖皮質(zhì)激素受體，使其分化為脂肪細胞。

此外，轉(zhuǎn)錄因子Oct-4是多能干細胞和原始生殖細胞表達發(fā)育多能性的標志性基因，Oct-4免疫細胞化學(xué)染色陽性提示細胞是更為原始、增殖和分化能力更強的細胞。這些結(jié)果表明，用上述方法從子宮內(nèi)膜組織中得到的細胞具有獨特的細胞化學(xué)特征和表型，可以確定為子宮內(nèi)膜基質(zhì)干細胞。但是，到目前為止還未發(fā)現(xiàn)其特異性的標志，子宮內(nèi)膜干細胞還有待于更深入的研究。

［1］PITTENGER M F，MACKAY A M，BECK S C，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells ［J］.Science，1999，284(5411):143-147.

［2］ZUK P A，ZHU M，ASHJIAN P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol Biol Cell，2002，13(12):4279-4295.

［3］GORO F，THOMAS T，HICOK K C.Differentiation of human marrow stromal precursor cells:Bone morphogenetic protein-2 increase OSF2/CBFA1，enhance osteoblast commitment，and inhabits late adipocyte maturation ［J］.J Bone Miner Bes，1999，14(9):1522-1535.

［4］CHAN R W，SCHWAB K E，GARGETT C E，et al.Clonogenicity of human endometrial epithelial and stromal cells［J］.Biol Rep rod，2004，70(6):1738-1750.

［5］CHAN R W，GARGETT C E.Identification of labelretaining cells in mouse endometrium ［J］.Stem Cells，2006，24(6):1529-1538.

［6］KATO K，YOSHIMOTOM，KATOK，etal.Characterization of side-population cells in human normal endometrium ［J］.Human Reproduction，2007，22(7):1214-1223.

［7］GARGETT C E.Uterine stem cells:What is the evidence ［J］.Human Reproduction Update，2007，13(1):87-101.

［8］YANG Xinyuan，CHEN Wei，LI Xu(楊新園，陳葳，李 旭).Comparative study on culture methods of endometrial stromal stem cells［J］.J Shanxi Med Univ(山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報)，2011，42(8):624-628.(in Chinese)

［9］CERVELLO I，MARTINEZ-CONEJERO JA，HORCAJADAS J A， et al.Identification，characterization and co-localization of labelretaining cell population in mouse endometrium with typical undifferentiated markers ［J］. Human Reproduction，2007，22(1):45-51.

［10］DU H，TAYLOR H S.Contributionofbone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis［J］.Stem Cells，2007，259(8):2082-2086.

［11］KERNS，EICHLER H，STOEVE J，etal.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow，umbilical cord blood or adipose tissue［J］.Stem Cells，2006，24(5):1294-1301.

［12］MALAVAL L，MODROWSKI D，GUPTA A K.Cellular expression of bone-related proteins during in vitro osteogenesis in rat bone marrow stromal cell cultures［J］.J Cell Physiol，1994，158(3):555.