肌肽對小鼠閉合性腦損傷的保護作用

裴旭穎，倪康欣，周 優(yōu)，應 琨，張翔南，厲旭云，陸 源，陳 忠

(1.浙江大學醫(yī)學院，浙江杭州 310058;2.浙江大學藥學院藥理教研室，衛(wèi)生部醫(yī)學神經(jīng)生物學重點實驗室，浙江杭州 310058;3.浙江大學醫(yī)學院生理學教研室，浙江杭州 310058）

顱腦外傷已成為發(fā)達國家青少年傷病致死的首位病因，近些年隨著我國國民經(jīng)濟和交通的快速發(fā)展，我國顱腦外傷發(fā)生率也逐年增加。數(shù)據(jù)表明，腦外傷的發(fā)生率約為1.07‰，其中，約60%的腦外傷由車禍造成，20% ～30%由墜落造成，約10%由毆打造成［1］。閉合性腦損傷可導致神經(jīng)系統(tǒng)損傷，造成認知、情感、行為能力的下降，甚至死亡。目前尚無特異的延緩腦損傷患者神經(jīng)功能損害的藥物。因此，加強對腦損傷治療的研究，積極研究和開發(fā)有效的腦保護藥物，尋找相關(guān)的藥物治療靶點，具有重要的現(xiàn)實意義。

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽［2］，能與大多數(shù)自由基相互作用，從而調(diào)節(jié)活性氧的含量并清除自由基。肌肽對缺血性腦損傷的保護作用已得到相關(guān)研究的證實，其機制可能與清除自由基、抗氧化以及抗細胞凋亡有關(guān)［3-4］，研究提示肌肽具有重要的神經(jīng)保護作用，可能是一種潛在的神經(jīng)保護劑。顱腦外傷誘導的腦損傷與缺血性腦損傷在病理機制上具有許多相似之處，如神經(jīng)興奮性毒性、炎性損傷等。另有研究表明，顱腦損傷引起的局部腦血供障礙本身就是一種局灶性的缺血性損傷。本研究通過建立實驗性小鼠閉合性腦損傷模型，探索肌肽的潛在保護作用，為臨床相關(guān)的藥物研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 90只雄性ICR小鼠，體重30 g左右(由浙江大學動物實驗中心提供)。遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，動物飼養(yǎng)溫度控制在(22±1)℃，12 h明暗循環(huán)，自由飲食、飲水。將小鼠隨機分為4組:假手術(shù)組(n=10)，溶劑對照組(n=30)，250 mg/kg肌肽組(n=30)和500 mg/kg肌肽組(n=20)。

1.2 藥品和儀器 肌肽(購自Sigma公司)，10%水合氯醛、4%多聚甲醛;閉合性腦損傷建模裝置，包括支架、帶刻度垂直導桿、下落擊錘(333 g)、可移動平臺等;神經(jīng)受損程度評分(neurological severity score，NSS)裝置，包括底部開口的圓形無蓋容器，三根寬度分別為1 cm、2 cm、3 cm的木桿，直徑0.7 cm的懸桿等;腦組織切片、HE染色設(shè)備，光學顯微鏡等。

1.3 小鼠閉合性腦損傷模型制作 模型制作參考Michael［5］等的自由落體撞擊傷模型，將小鼠經(jīng)10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉后，用PVP碘消毒頭皮，沿頭皮正中線從耳后到眼部將皮膚剪開，分離骨膜，在冠狀縫與人字縫連線中點向右旁開3～5 mm處標記撞擊點，使撞擊桿從3 cm高處自由下落致小鼠閉合性腦損傷。術(shù)后立即給予小鼠醫(yī)用氧氣(20%O2+5%CO2)2 min以防止呼吸抑制，縫合頭皮后放于25℃保溫箱中復蘇。假手術(shù)組小鼠麻醉后按相同方法剪開頭皮，但不做撞擊，直接縫合頭皮。

1.4 給藥方案 從術(shù)前30 min開始，肌肽組按照10 ml/kg給藥，分別腹腔注射肌肽250 mg/kg 和500 mg/kg［6］，溶劑對照組及假手術(shù)組腹腔注射等量生理鹽水，以后每日同一時間按相同方法給藥。

1.5 行為學評分 參照Michael［5］等的NSS標準(表1)，在實驗的第1天～第7天的相同時間對各組小鼠進行NSS評價。

1.6 組織病理學觀察 實驗結(jié)束后于第7天麻醉處死小鼠，分別取小鼠腦組織并用4%多聚甲醛固定72 h，制成石蠟切片并進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織變化。

1.7 統(tǒng)計學處理 用SPSS 17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。小鼠體重用均數(shù)±標準差)表示，以單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多組間差異的比較;小鼠生存率用χ2檢驗;NSS數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位數(shù)(Median，Quartiles)表示，采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 小鼠神經(jīng)受損程度評分Table 1 Neurological severity score for mice

2 結(jié)果

本研究在統(tǒng)計時剔除因麻醉過量死亡的小鼠(其中，假手術(shù)組3只、溶劑對照組1只、250 mg/kg肌肽組2只和500 mg/kg肌肽組1只)和閉合性腦損傷造模失敗的小鼠(其中，溶劑對照組3只、250 mg/kg肌肽組6只和500 mg/kg肌肽組2只)。

2.1 存活率分析 假手術(shù)組小鼠閉合性腦損傷后第1天～第7天均無死亡;溶劑對照組術(shù)后第1天存活率為57.7%(15/26)，術(shù)后第7天最終存活率為50%(13/26)。250 mg/kg肌肽組術(shù)后第1天的存活率為68.2%(15/22)，術(shù)后第2天～第7天無新增死亡例數(shù)，最終存活率與溶劑對照組比較差異無顯著性;500 mg/kg肌肽組術(shù)后第1天的存活率為82.4%(14/17)，術(shù)后第2天～第7天也無新增死亡例數(shù)，其最終存活率較溶劑對照組高，經(jīng)χ2檢驗差異有顯著性(P ＜0.05)。

2.2 損傷后7 d內(nèi)小鼠體重的變化 假手術(shù)組、溶劑對照組及肌肽給藥組小鼠體重在術(shù)后第1天均降低，且溶劑對照組下降最多，假手術(shù)組下降最少。術(shù)后3d內(nèi)各組小鼠體重呈現(xiàn)波動性下降趨勢;至術(shù)后第4天，假手術(shù)組、肌肽組小鼠體重逐漸恢復，而溶劑對照組體重恢復落后于其他3組，至第5天體重才逐漸恢復，但始終為4組小鼠中最低。術(shù)后第1天～第7天，500 mg/kg肌肽組小鼠體重均高于250 mg/kg肌肽組和溶劑對照組;250 mg/kg肌肽組體重均高于溶劑對照組，但3組間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖1)。

圖1 肌肽對小鼠閉合性腦損傷7 d內(nèi)體重變化的影響Fig.1 Effects of carcinose on body weight over 7 days after closed head injury in mice

2.3 肌肽對閉合性腦損傷小鼠行為學的影響

溶劑對照組第1天～第7天的NSS均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，提示自由落體造模成功。與溶劑對照組比，250 mg/kg肌肽組術(shù)后第5天～第7天可顯著降低小鼠NSS(P＜0.05)，500 mg/kg肌肽組術(shù)后第1天及第4天～第7天可顯著降低NSS(P＜0.05，表2)。

表2 閉合性腦損傷小鼠神經(jīng)癥狀NSS評分Table 2 Neurological Severity Scores after closed head injury in mice ［Median(P25～P75)］

2.4 肌肽對閉合性腦損傷小鼠組織病理學的影響 溶劑對照組和給藥組小鼠自由落體腦損傷術(shù)后第7天，冠狀大腦皮層組織病理切片經(jīng)HE染色后，可見損傷側(cè)半腦蛛網(wǎng)膜下腔充血，腦血管水腫、充血，腦實質(zhì)細胞變性壞死，部分神經(jīng)元細胞核固縮，并存在不同程度炎癥細胞及小膠質(zhì)細胞增生、浸潤。250 mg/kg及500 mg/kg肌肽均能顯著減輕損傷側(cè)的腦損傷，減少出血及充血，降低炎性細胞的浸潤，尤以500 mg/kg肌肽的保護作用更為顯著(圖2)。

3 討論

腦外傷研究目前常用的模型有凍傷型、液壓型及自由落體型。凍傷和液壓模型不能很好地模擬臨床上因墜擊、交通事故等造成的閉合性腦外傷，相比之下，自由落體模型能更好地代表臨床閉合性腦外傷的形成過程和病理特征，是一種理想的腦外傷模型。本研究采用文獻［5］的方法，改進自由落體裝置，選用小鼠作為實驗動物，經(jīng)自由落體敲擊損傷后，動物表現(xiàn)出呼吸抑制、神經(jīng)功能降低，在組織學層面，可見受損大腦皮層出現(xiàn)凝血塊及組織損傷，并伴有死亡固縮的神經(jīng)元及炎性細胞浸潤，這些表型及病理學特征均較好地模擬了臨床常見的閉合性腦損傷，提示該模型可用于腦外傷相關(guān)的病理生理學及藥理學研究。

目前臨床對腦外傷尚無十分有效的治療藥物，相關(guān)神經(jīng)保護劑的使用是一種重要的治療策略。肌肽作為一種天然存在的二肽，由β-丙氨酸和L-組氨酸組成，廣泛存在于人體多種組織中，尤以骨骼肌以及新陳代謝旺盛的腦組織為多［2，7］。本課題組長期從事肌肽的抗缺血性腦損傷活性及相關(guān)機制研究，前期工作發(fā)現(xiàn)，肌肽可能通過清除自由基、抗氧化以及抗谷氨酸介導的細胞興奮性毒性作用等機制發(fā)揮其保護作用［4，8］。閉合性腦損傷與缺血性腦損傷存在相似之處［9］，但又較后者更為復雜。因此，結(jié)合課題組前期研究，推測肌肽可能同樣具有抗腦外傷活性。本研究的結(jié)果表明，肌肽可顯著提高小鼠閉合性腦損傷后7 d內(nèi)的存活率，并可顯著促進小鼠腦損傷后期神經(jīng)功能的恢復，但對前期的保護作用不甚明顯，且500 mg/kg肌肽較250 mg/kg肌肽更早顯現(xiàn)出神經(jīng)保護作用。組織病理學結(jié)果提示，肌肽可減輕腦組織充血及膠質(zhì)細胞浸潤，提示肌肽可能是一種潛在的抗閉合性腦損傷的保護藥物。目前，肌肽已廣泛用于保健品，至今尚無關(guān)于肌肽副反應的報道［6］。因此，相比臨床上已應用的神經(jīng)保護藥物，肌肽具有更好的藥物安全性，有望成為臨床治療腦外傷的理想藥物。

圖2 小鼠閉合性腦損傷第7天后腦組織病理學變化Fig.2 Histological alternations 7 days after closed head injury in mice

目前研究認為，閉合性腦損傷病理機制包括炎癥反應、氧化應激、離子失衡及興奮性毒性作用等［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，肌肽能顯著減少閉合性腦損傷后炎癥細胞的浸潤，初步提示抗炎癥反應可能是肌肽發(fā)揮保護作用的重要機制之一。肌肽能通過血腦屏障［12］，在腦組織中代謝為組胺;組胺作為一種活性物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮了重要的抗炎作用。因此，肌肽的保護作用是否經(jīng)由代謝產(chǎn)生組胺而發(fā)生，尚需進一步深入研究。

綜上所述，本研究首次證實了肌肽對抗閉合性腦損傷的神經(jīng)保護作用，肌肽可能是一種潛在的抗腦外傷藥物。

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