腸道桿菌耐藥性及其耐藥相關(guān)Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)結(jié)構(gòu)與進(jìn)化

王 歡，包其郁，孫愛(ài)華，趙金方，葛玉梅，嚴(yán) 杰

(1.浙江省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江杭州 310014;2.溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035;3.浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，浙江杭州 310053;4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江杭州 310006;5.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，浙江杭州 310058）

近年來(lái)我國(guó)及東南亞地區(qū)臨床耐藥菌株、尤其是耐多種抗生素的多重耐藥菌株的分離率逐年增高，其中大腸埃希菌、陰溝桿菌、不動(dòng)桿菌等革蘭陰性腸道所占比例較大［1-3］。上述細(xì)菌主要引發(fā)醫(yī)院感染，包括呼吸道感染、敗血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎等［4］。

整合子(integron)是細(xì)菌基因組中一種介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座元件，其功能與細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5-7］。典型的整合子結(jié)構(gòu)由保守區(qū)和可變區(qū)兩部分組成，前者為整合酶編碼基因所在區(qū)域活性，后者由串聯(lián)排列的耐藥基因盒組成，迄今發(fā)現(xiàn)的整合子相關(guān)耐藥基因盒至少有數(shù)十種，所含耐藥基因幾乎覆蓋了目前臨床上使用的所有抗菌藥物［8，9］。根據(jù)整合酶序列不同，可將整合子分為六型，其中以Ⅰ類(lèi)整合子最為常見(jiàn)［10-11］。整合子不僅可通過(guò)位點(diǎn)特異性重組的方式捕獲耐藥基因，從而形成多種耐藥基因的組合，同時(shí)還可介導(dǎo)耐藥基因在染色體、質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子之間移動(dòng)，導(dǎo)致耐藥基因的水平播散［12-13］。本研究中，我們檢測(cè)了臨床標(biāo)本中分離的大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性，采用PCR及產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)與分析了上述菌株Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)基因盒，同時(shí)以二氫葉酸還原酶基因?yàn)榘谢驅(qū)Β耦?lèi)整合子系統(tǒng)發(fā)生、進(jìn)化進(jìn)行分類(lèi)和比較。

1 材料與方法

1.1 臨床菌株來(lái)源與鑒定 參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)，采用法國(guó)bioMérieux公司VITEK60全自動(dòng)細(xì)菌檢測(cè)分析系統(tǒng)及其配套的細(xì)菌鑒定卡GPI，從溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床送檢的體液(血液、腹水等)、分泌物(痰液、膿液、傷口分泌液等)標(biāo)本中分離并鑒定了24株大腸埃希菌(Escherichia coli)、28株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)和24株鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)。

1.2 藥物敏感試驗(yàn) 采用K-B法并根據(jù)CLSI 2008標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。各類(lèi)抗菌藥物紙片如下:氨芐西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、頭孢替坦(CTT)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)、丁胺卡那(AMI)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、環(huán)丙沙星(CIP)、左旋氧氟沙星(LVX)、復(fù)方新諾明(SMZ)、泰能(TIE)和呋喃妥因(NIT)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922株，購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.3 細(xì)菌基因組DNA制備 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(GENEray)提取各受試菌株基因組DNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度［14］。

1.4 PCR 以 GenBank中Ⅰ類(lèi)整合子序列(accession No.:AM939644)為參照，采用Primer Premier 6.0軟件在可變區(qū)兩端保守序列中設(shè)計(jì)通用引物。引物委托上海Invitrogen公司合成。上游引物序列:5'-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3'，下游引物序列:5'-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3'。采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa)擴(kuò)增各菌株中Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)片段。反應(yīng)總體積 50μl，內(nèi)含:2.5 mol/L dNTP、200 nmol/L 各引物、15 mol/L MgCl2、2.5U EXTaq DNA聚合酶、100 ng DNA模板和1×PCR緩沖液(pH 8.3)。PCR參數(shù):95℃ 5 min;94℃1 min、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃10 min。采用溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及分析 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BioColor)回收目的擴(kuò)增片段，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將其克隆至pMD-19T質(zhì)粒中，然后電轉(zhuǎn)化入 E.coli DH5α(Invitrogen)并在LB培養(yǎng)液(Oxoid)中擴(kuò)增，氨芐西林和藍(lán)白斑雙重篩選后委托上海Sangong公司測(cè)序［14］。采用BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和比較。

1.6 進(jìn)化樹(shù)分析 以Ⅰ類(lèi)整合子中最為常見(jiàn)的二氫葉酸還原酶基因?yàn)榘谢?，先采用ClustalX1.8軟件與Swissport庫(kù)中的不同亞型二氫葉酸還原酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，然后采用MEGA系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件中的NJ方法，構(gòu)建Ⅰ類(lèi)整合子中二氫葉酸還原酶基因的分子進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌耐藥率檢測(cè)結(jié)果 24株大腸埃希菌、28株陰溝腸桿菌、24株鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示:三種細(xì)菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥，但鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)大多數(shù)抗生素耐藥率高于大腸埃希菌和陰溝腸桿菌，對(duì)哌拉西林(PIP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)及呋喃妥因(NIT)耐藥率甚至高達(dá)100%，大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對(duì)頭孢曲松頭孢替坦(CTT)、(CRO)和頭孢他啶(CAZ)耐藥率也高達(dá)41.6% ～62.5%(表1)。

2.2 Ⅰ類(lèi)整合子的檢出率 24株大腸埃希菌、28株陰溝腸桿菌、24株鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類(lèi)整合子檢出率分別為 62.5%(15/24)、67.9%(19/28)和83.3%(20/24)。見(jiàn)表 2。

2.3 Ⅰ類(lèi)整合子譜型 54株檢出Ⅰ類(lèi)整合子菌株(15株大腸埃希菌、19株陰溝腸桿菌和20株鮑曼不動(dòng)桿菌)中，有44株呈單一陽(yáng)性條帶，多數(shù)為1.7 kb條帶(25株)，其余為1.5 kb(10株)、0.75 kb(5 株)和 1.0 kb(4 株)條帶(圖1);有5株同時(shí)檢出2條帶，分別有0.75/1.70 kb(3 株)、0.75/1.0 kb(1 株)和1.0/1.70 kb(1株)三種組合方式(圖2)。

2.4 Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)基因盒分析結(jié)果 在11株大腸埃希菌、15株陰溝腸桿菌和15株鮑曼不動(dòng)桿菌中有5種不同類(lèi)型的基因盒:分別為 aac(6')、sad(3″)、aad(2″)、cat(4')和 dfr(含7、A13、15 三個(gè)亞型)，aac(6')、sad(3″)和 dfr 15能以單基因方式存在，有4種雙基因組合方式、1種三基因組合方式(表3)。aac(6')為(Aminoglycoside N(6')-acetyltransferase)基因，sad(3″)為鏈霉素腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(streptomycin 3″-adenylyltransferase)基因，aad(2″)是 (aminoglycoside nucleotidyltransferase)基因，cat(4')是(chloramphenicol acetyltransferase)基因，可分別介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素及氯霉素耐藥。dfr 7、dfr A13和 dfr 15為二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)基因可賦予細(xì)菌對(duì)甲氧芐啶的耐藥性。然而，上述菌株Ⅰ類(lèi)整合子中未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶基因。

表1 大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率Table 1 Resistance rates of E.coli，E.cloacae and A.baumannii

表2 大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌I型整合子檢出率Table 2 Positive rates of class-Ⅰ integron in E.coli，E.cloacae and A.baumannii

圖1 Ⅰ類(lèi)整合子單條帶譜型Fig.1 Spectral patterns of class-Ⅰintegrons with single bands

圖2 Ⅰ類(lèi)整合子雙條帶譜型Fig.2 Spectral patterns of class-Ⅰ integrons with double bands

3.5 二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果

上述菌株Ⅰ類(lèi)整合子所攜帶的二氫葉酸還原酶基因可歸納為4組:①重疊群9(Ctg9)二氫葉酸還原酶基因與15型二氫葉酸還原酶基因接近;②重疊群1和15(Ctg1和Ctg15)二氫葉酸還原酶基因與5型二氫葉酸還原酶基因接近;③重疊群14a和14b(Ctg14a和Ctg14b)二氫葉酸還原酶基因與7型二氫葉酸還原酶基因接近;④重疊群20和21(Ctg20和Ctg21)二氫葉酸還原酶基因與13型二氫葉酸還原酶基因接近(圖3)，提示上述菌株Ⅰ類(lèi)整合子有4條不同的系統(tǒng)發(fā)生或進(jìn)化途徑。

表3 Ⅰ類(lèi)整合子基因盒的構(gòu)成及其分布Table 3 Composition and distribution of gene cassettes in class-Ⅰintegron

圖3 Ⅰ類(lèi)整合子中二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tress of dihydrofolate reductase genes in class-Ⅰintegrons

3 討論

大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，且這些細(xì)菌普遍存在耐藥或多重耐藥現(xiàn)象［1，3，15-16］。與歐美國(guó)家或地區(qū)比較，亞洲地區(qū)各種臨床分離菌株對(duì)抗生素耐藥率普遍較高，其中大腸埃希菌對(duì)頭孢曲松和氧氟沙星耐藥率分別為為67.6%和 65.0%，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)哌拉西林耐藥率高達(dá)70.5%，陰溝腸桿菌對(duì)頭孢西丁的耐藥率甚至 高 達(dá) 93.7%［1，4，17，18］。我 們的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性最強(qiáng)，對(duì)臨床常用的三代頭孢類(lèi)抗生素頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)及青霉素類(lèi)抗生素哌拉西林(PIP)耐藥率為100%，對(duì)氨芐西林(AMP)耐藥率也高達(dá)70.8%;陰溝腸桿菌對(duì)受試的3種三代頭孢類(lèi)抗生素(CTT、CRO、CAZ)、3 種氨基糖苷類(lèi)抗生素(AMI、GEN、TOB)和2種喹諾酮類(lèi)抗生素(CIP、LVX)耐藥率高達(dá) 46.4% ～71.4%，明顯高于大腸埃希菌(表1)，表明臨床上耐藥菌株流行狀況已十分嚴(yán)重。細(xì)菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，僅基因突變和耐藥質(zhì)粒已無(wú)法完全解釋細(xì)菌快速獲得耐藥性的現(xiàn)象。整合子可捕獲耐藥基因并通過(guò)整合酶將其整合后表達(dá)，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，又能介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移，為深入研究細(xì)菌耐藥及播散機(jī)制提供了新方向［9］。整合子分成兩大群:可移動(dòng)整合子和超級(jí)整合子［8］?？梢苿?dòng)整合子又被分成五類(lèi)(Ⅰ～Ⅴ)，不同整合子類(lèi)型中基因盒數(shù)目不盡相同，也非所有基因盒均可介導(dǎo)耐藥性。可移動(dòng)Ⅰ類(lèi)整合子廣泛地分布于寄生性和腐生性菌株中，在革蘭陰性臨床菌株中，Ⅰ類(lèi)整合子更為常見(jiàn)且有較高的耐藥基因攜帶率［10，13，19］。超級(jí)整合子基因盒中除耐藥基因外，還包含許多參與環(huán)境適應(yīng)的功能蛋白編碼基因。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌中Ⅰ類(lèi)整合子總檢出率高達(dá)71.1%(54/76)，其中鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類(lèi)整合子檢出率(83.3%)高于大腸埃希菌(62.5%)和陰溝腸桿菌(67.9%);各菌株攜帶的Ⅰ類(lèi)整合子有高度異質(zhì)性，表現(xiàn)為不同大小單條帶或雙條帶組合多種譜型，提示這些菌株Ⅰ類(lèi)整合子功能活躍。

大多數(shù)耐藥基因盒由Ⅰ類(lèi)整合子攜帶，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)(青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi))、喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和喹諾酮類(lèi)及磺胺類(lèi)抗性基因［8，9］。然而，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中僅發(fā)現(xiàn) aac(6')、sad(3″)、aad(2″)、cat(4')、dfr(7、A13 和 15 亞型)等與氨基糖苷類(lèi)、氯霉素和磺胺類(lèi)耐藥有關(guān)基因，未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶基因，但受試的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(AMP、PIP、CRO、CAZ、CTT)耐藥率高達(dá) 54.2% ～100%，陰溝腸桿菌和大腸埃希菌對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗生素(CRO、CAZ、CTT)耐藥率也分別高達(dá)46.4% ～50%和41.6% ～62.5%，這提示上述菌株對(duì) β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性可能涉及基因突變和耐藥質(zhì)粒等其他耐藥機(jī)制，與Ⅰ類(lèi)整合子無(wú)關(guān)。

在各種抗生素廣泛使用的情況下，細(xì)菌的耐藥性基因也在不斷發(fā)生變化并逐漸發(fā)展出不同的基因型。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶即有數(shù)百種不同的基因型，僅CTM-X就有近60個(gè)型別［21］，介導(dǎo)磺胺類(lèi)耐藥的二氫葉酸還原酶基因也有近20個(gè)基因型［22］。本研究中I型整合子基因盒主要結(jié)構(gòu)基因二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生的分析結(jié)果顯示，所發(fā)現(xiàn)的二氫葉酸還原酶基因可分成4組，分別與15型、5型、7型和13型二氫葉酸還原酶基因接近，提示在藥物選擇性壓力下，Ⅰ類(lèi)整合子有4條不同的系統(tǒng)發(fā)生或進(jìn)化途徑，所攜帶的二氫葉酸還原酶基因呈現(xiàn)為多樣性。

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