哺乳動物促性腺激素抑制激素的生殖內分泌調節(jié)與行為作用

孟凡森，陳學群，杜繼曾 綜述

(浙江大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學系，浙江 杭州 310058)

哺乳動物腦內促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)于上世紀70年代初被分離、證實［1-2］。經(jīng)過近30年的研究，認為GnRH是唯一參與調節(jié)垂體促性腺激素釋放的神經(jīng)肽。直到2000年，日本科學家Kazuyoshi Tsutsui首次從鵪鶉腦中分離并提純了一種含有12個氨基酸的神經(jīng)肽，由于它呈劑量依賴性地抑制前垂體細胞釋放GnRH，被命名為促性腺激素抑制激素(Gonadotropininhibitory hormone，GnIH)［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中促性腺激素抑制激素RFRP不但調控生殖功能，還參與了季節(jié)性繁殖、應激反應、攝食以及焦慮行為等。

1 RFRP及其受體在腦內的分布(表1)

哺乳動物RFRP基因只編碼2種成熟肽RFRP-1和RFRP-3。研究報道在大鼠中腦室注射RFRP-1，可以呈劑量依賴性地促進催乳素的釋放［10］，而 RFRP-3與鳥類 GnIH功能相似。目前 RFRP-3 已經(jīng)在大鼠［11］、牛［12］、獼猴［13］和人［14］中被分離純化。經(jīng)免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，RFRPs(主要是RFRP-1)在小鼠中主要分布于間腦、腦橋和髓質以及下丘腦背內側核(DMH)等區(qū)域［15］，而大鼠的RFRP-3神經(jīng)元細胞體主要集中在DMH、結節(jié)乳頭區(qū)和腹內側核周圍區(qū)域［16］。另一抗體的免疫組化和原位雜交研究發(fā)現(xiàn)，RFRP神經(jīng)元細胞體僅存在于倉鼠、大鼠以及小鼠的DMH［17］。一種多克隆抗體(用第119-132位RFRP前體肽氨基酸殘基的序列作為免疫原)的免疫組化研究進一步證實，RFRP神經(jīng)元胞體主要集中在大鼠DMH［18］。

原位雜交實驗結果顯示，RFRP-3神經(jīng)元存在于羊的下丘腦室旁核(PVN)和背內側核腹側［19］。利用不同抗體的免疫組化方法進一步證明了這一研究結果，原位雜交方法也獲得類似結果，但唯一不同的是經(jīng)歷長周期光照(16∶8)的母羊室管膜RFRP免疫信號呈陽性［20］。

最近發(fā)現(xiàn)，靈長類動物雄性獼猴大腦PVN區(qū)中存在RFRP mRNA和免疫陽性細胞，并有大量的神經(jīng)纖維投射到正中隆起［13］。但雌性獼猴中很少有神經(jīng)纖維投射到正中隆起［21］。2009年 Ubuka實驗室鑒定了人類大腦中的RFRP肽和其受體，發(fā)現(xiàn)RFRP神經(jīng)元胞體主要分布在DMH，其軸突投射到視前區(qū)的GnRH神經(jīng)元和正中隆起［14］。值得注意的是，在倉鼠［17］、羊［19-20］和靈長類［14］的正中隆起處均觀察到 RFRP 神經(jīng)元末梢，但大鼠中沒有［16，19］。

表1 RFRP受體及其纖維投射分布Table 1 Distribution of RFRP fibers and RFRP receptor

RFRP神經(jīng)元纖維廣泛地投射到哺乳動物大腦的各個區(qū)域。在大鼠腦內，RFRP-3投射到下丘腦各個核團，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)末梢在杏仁核、終紋床核和丘腦室旁核等處。在GnRH神經(jīng)元密集存在的區(qū)域視前區(qū)、隔核、布羅卡斜帶中也有RFRP-3分布［16］。免疫組化雙標研究顯示，40%～80%的GnRH神經(jīng)元胞體和RFRP神經(jīng)元纖維在DMH區(qū)緊密連接。這些結果在靈長類［13］、大鼠［16-17］、羊［22］、倉鼠［17］和小鼠［23］的腦內也被發(fā)現(xiàn)，與鳥類中的研究結果相似。

研究報道，RFRP受體在大鼠下丘腦高度表達，在丘腦、中腦、髓質、眼和睪丸中度表達［10］;在羊的視交叉、視束上核、室旁核和結節(jié)部有分布［20］;在人類脊髓、杏仁核、尾狀殼核、海馬、黑質和丘腦表達［24］。此外，RFRP受體mRNA在大鼠垂體中有表達，而在人類垂體中沒有發(fā)現(xiàn)［25］。

2 RFRP與生殖行為

2.1 對GnRH的調節(jié) 生殖軸整合大量直接或間接神經(jīng)化學物質的信息輸入并調節(jié)動物的生殖過程。對鳥類的研究已經(jīng)證明，GnIH可以通過GnRH神經(jīng)元上的受體抑制GnRH的釋放［26］。大量的哺乳動物研究顯示，GnRH神經(jīng)元與RFRP神經(jīng)纖維有緊密地連接［7］。在切除卵巢的倉鼠(未給予雌激素處理)［17］和性腺完好的大鼠(雌雄)中［16，27］，腦室注射 RFRP-3 降低了血漿促黃體生成素(LH)的水平，推測這是RFRP-3作用于 GnRH神經(jīng)元的結果。Anderson等通過檢測早期基因(c-fos)的方法發(fā)現(xiàn)，在切除卵巢的大鼠(給予雌激素或孕酮)中，RFRP-3減弱了GnRH的活動，同時也減弱了前腹側室旁核(提供GnRH神經(jīng)元刺激信號輸入的區(qū)域)神經(jīng)元的活動［27］。但是，在此實驗中LH的釋放并沒有發(fā)生顯著的變化。電生理學研究顯示，在雄性和雌性小鼠的腦片上，RFRP-3可以抑制GnRH神經(jīng)元的發(fā)放頻率，其中約43%的GnRH神經(jīng)元神經(jīng)沖動釋放頻率減少，9%的GnRH神經(jīng)元沖動的釋放頻率反而增加［28］。最新研究發(fā)現(xiàn)，西伯利亞倉鼠的下丘腦視前區(qū)(GnRH神經(jīng)元細胞體聚集區(qū)域)存在RFRP受體，免疫熒光結果顯示，GnRH神經(jīng)元上存在 RFRP受體［29］。這是第一次在 GnRH神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)RFRP受體，提示RFRP通過其受體在中樞調節(jié)GnRH，最終調節(jié)生殖功能，這對于全面闡述RFRP在調節(jié)生殖方面的重要作用有著非常重大的意義。

2.2 對垂體生殖激素的調節(jié) RFRP在外周作用于垂體。給予切除卵巢的大鼠靜脈注射RFRP-3對LH的基礎濃度沒有影響，但顯著降低了 GnRH刺激引起的 LH釋放［18］。然而，Murakami等卻報道了一個相反的結果:給切除卵巢大鼠靜脈注射RFRP-3降低了血漿LH，而腦室注射RFRP-3、LH的濃度和LH釋放頻率都沒有明顯變化［30］。為了進一步解釋說明在大鼠中存在的差異性，最近Pineda等在大鼠中做了一個比較系統(tǒng)的研究［31］，研究者人工合成了不同的 RFRP類似物，包括2種 RFRP-1(RFRP1-12、RFRP1-20)和 2 種 RFRP-3(RFRP3-8、RFRP3-17)，利用腦室或靜脈注射的方法，研究它們對LH和FSH的影響以及對體外培養(yǎng)的垂體細胞的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)，①在切除卵巢的雌鼠中，腦室注射RFRP類似物后，只有RFRP3-8(含有8個氨基酸殘基的RFRP類似物)可以抑制LH的釋放，而RFRP3-17只有在高濃度時才有明顯抑制LH釋放的作用。2種濃度的類似物對FSH的釋放無影響。②在成年雄性大鼠(性腺未切除)中，腦室注射RFRP3-8明顯抑制LH，而FSH無變化;而在性腺切除的成年雄性大鼠中，實驗結果相反。③靜脈注射RFRP3-8后，在30～60 min可觀察到LH的水平顯著下降。在60～90 min內FSH水平下降。④在體外培養(yǎng)的切除性腺的雄性大鼠垂體細胞中，LH釋放RFRP3-8呈劑量依賴性降低，而FSH沒有顯著的變化。

給予去卵巢母羊靜脈注射RFRP-3后，發(fā)現(xiàn)LH的水平顯著性降低，但是對垂體分泌的其他激素(生長激素和催乳素)沒有任何影響［19］，在牛的研究中也得到了同樣的結果［32］。在大鼠［30］、羊［19］和牛［32］的原代垂體細胞實驗中，RFRP-3沒有減少LH基礎水平的釋放，而是呈劑量依賴性地減少了GnRH刺激引起的LH釋放。還有2個證據(jù)證明了RFRP-3對垂體的直接作用。第一，RFRP-3消除了GnRH刺激引起的促性腺細胞內鈣的動員［19］;第二，GnRH刺激引起的羊垂體細胞LH β mRNA的升高可以被 RFRP-3 抵消［33］;此外，GnRH 刺激引起的細胞外信號調節(jié)激酶的磷酸化(ERK)也可以被RFRP-3消除［33］。這表明RFRP-3也可以通過第二信使信號通路抑制促性腺激素的合成。研究發(fā)現(xiàn)，RFRP-3可以減少GnRH刺激引起的體外羊垂體細胞FSH的釋放［19］和FSH β mRNA 基因的表達［33］。

2.3 對性腺激素的調節(jié) 2000年第一次發(fā)現(xiàn)哺乳動物RFRP及其受體時，就確定其在大鼠睪丸內中度表達［10］。最近運用RT-PCR、原位雜交以及免疫熒光標記等方法，發(fā)現(xiàn)RFRP及其受體在敘利亞倉鼠的睪丸中的表達與生精周期有關，RFRP-3前體表達主要集中在曲精管［34］。在RFRP低水平表達的曲精管中，存在大量增殖的生殖細胞，提示RFRP可能對精子產生有抑制作用［35］?？傊?，哺乳動物睪丸中RFRP可能通過旁分泌或自分泌抑制生殖細胞增殖和分化。

排卵前期是LH釋放的高峰，而在動情周期的其他時期，雌激素通過負反饋抑制LH釋放。Gibson等研究了RFRP與LH釋放的關系［36］。目前形態(tài)學已經(jīng)證明視交叉上核對RFRP的節(jié)律控制。如注射生物素葡聚糖胺(BDA)示蹤劑的研究發(fā)現(xiàn)，雌性敘利亞倉鼠中視交叉上核存在大量神經(jīng)元投射到RFRP神經(jīng)元集中的區(qū)域:DMH及其周圍區(qū)域。在LH峰期間，DMH的RFRP免疫陽性細胞減少，處于激活狀態(tài)的RFRP細胞減少;LH峰過后，陽性細胞數(shù)量恢復到基礎水平。結果說明RFRP的節(jié)律性調節(jié)，而且提示可能參與排卵過程。另有研究雌激素對RFRP的作用，免疫熒光雙標實驗發(fā)現(xiàn)DMH大約有39%的RFRP神經(jīng)元細胞與雌二醇受體共存。給卵巢切除的敘利亞倉鼠皮下注射雌激素，結果顯示，注射雌激素組RFRP神經(jīng)元的激活數(shù)目在3h和6h后都有顯著性升高［17］。在動情周期的小鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)GnRH和受體，結果提示GnRH和RFRP-3的相互作用共同參與了小鼠卵泡的發(fā)育和調控［37］。

3 RFRP與繁殖行為

Johnson等在雄性大鼠中證明了 RFRP-3對生殖行為的調節(jié)。分別在白晝給雄性大鼠腦室注射RFRP-3觀察其對生殖行為的影響［16］。實驗結果表明白天注射RFRP-3減少了生殖行為，而夜晚注射RFRP-3對生殖行為沒有影響。

研究季節(jié)性繁殖的動物模型的動物通常是羊和倉鼠。羊是短日照繁殖的哺乳動物，DMH的RFRP蛋白的表達在非繁殖期高于繁殖期［22］，同時發(fā)現(xiàn)投射到GnRH神經(jīng)元的RFRP神經(jīng)元數(shù)目在非繁殖期也高于繁殖期。同樣處于人工模擬長日照的羊，下丘腦RFRP基因的表達比繁殖期高［20］。所以推測RFRP可能是羊在非繁殖期抑制生殖功能的主要調節(jié)激素。然而羊在超長日照條件下(20 h或22 h)，RFRP基因的表達沒有顯著性變化。這些結果表明抑制效應不僅是通過長日照使RFRP基因表達增加，也與非繁殖期RFRP投射到GnRH細胞上的數(shù)目增加有關［22］。

在長日照繁殖的雄性敘利亞倉鼠和西伯利亞倉鼠中，免疫組織化學方法和原位雜交技術結果顯示RFRP的表達在非繁殖期降低［38］，而且西伯利亞倉鼠在長日照的條件下RFRP前體的mRNA表達升高［29］。最近研究報道，在短日照條件下(非生殖期)的雄性敘利亞倉鼠中，發(fā)現(xiàn)RFRP免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目及其mRNA的表達比長日照條件下顯著減少［39］。另一組研究報道，在模擬繁殖季節(jié)的長日照條件下西伯利亞倉鼠RFRP基因表達減少，當將其轉入短日照時，RFRP 基因的表達增加［40］。

RFRP受褪黑激素的調節(jié)。在長日照繁殖的鳥類中，短日照模擬非繁殖期，褪黑激素分泌增加使鳥類GnIH的表達升高，抑制鳥類的生殖［41］。然而，在同樣是長日照繁殖的敘利亞倉鼠中，給予短日照條件RFRP表達降低，松果體切除的方法可以恢復RFRP的表達，提示褪黑素在敘利亞倉鼠中抑制RFRP的表達;如果給予長日照條件，同時褪黑激素注射處理60 d，可以降低RFRP表達［38］。最近的研究顯示短日照條件下，切除松果體的西伯利亞倉鼠，給予不同濃度的褪黑激素都可以使RFRP前體的mRNA的表達降低［29］。倉鼠和鳥類都是長日照繁殖動物，但它們之間有很多的差異。

4 RFRP與攝食行為

動物通過增加攝食儲存能量為生殖和繁殖行為做準備。大鼠下丘腦背內側核(DMH)是調節(jié)食欲和能量平衡的中心，同時又是RFRP神經(jīng)元胞體集中的地方，所以推測RFRP與攝食行為直接相關。最初在鳥類中發(fā)現(xiàn)GnIH可以促進鳥類攝食［42］，RFRP-3在雄性大鼠中也有同樣的作用［16］，隨后在雌性大鼠中也證實了這個結果［30］。這是第一次確定了下丘腦背內側核區(qū)域參與能量調節(jié)的神經(jīng)元細胞類型。研究表明羊的RFRP神經(jīng)元投射到神經(jīng)肽Y和黑皮質素兩種肽聚集的大腦區(qū)域［43］，而這兩種神經(jīng)肽都具有調節(jié)攝食和生殖的功能(神經(jīng)肽Y促進攝食和負性調節(jié)生殖;黑皮質素負性調控攝食和激活生殖軸)。但限制雄性西伯利亞倉鼠進食(模擬倉鼠在夏季末生活的自然條件)，并沒有發(fā)現(xiàn)RFRP表達的改變［40］。RFRP對能量和氧消耗的作用還需要進一步的深入研究。

5 RFRP與焦慮行為

腦室注射RFRP-1和RFRP-3后，大鼠曠場行為實驗檢測發(fā)現(xiàn)其在曠場中間活動的時間減少，在曠場中總活動減少，提示 RFRP-1和RFRP-3引起了大鼠的焦慮樣行為［44］。在大鼠酒精撤退模型中，RFRP非選擇性受體拮抗劑可以減弱動物焦慮行為［45］。這些數(shù)據(jù)提示，RFRP和受體系統(tǒng)的激活可以引起動物的焦慮樣行為。然而在羊中卻得到了不同結果［46］，采用隔離束縛的心理應激方法研究發(fā)現(xiàn)，應激后RFRP-3蛋白和mRNA無顯著變化，表達Fos蛋白的RFRP神經(jīng)元數(shù)目也沒有變化。但糖皮質激素顯著性升高，LH明顯下降。這些結果提示心理社會應激可能沒有激活RFRP系統(tǒng)，RFRP可能不是心理社會應激引起LH變化的主要調節(jié)因子。我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn)妊娠期母體間歇低氧應激可以引起子代雄性大鼠的焦慮樣行為，而雌性大鼠沒有［47］。由于PVN是應激激活的促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)神經(jīng)元主要聚集區(qū)域，同時也是RFRP神經(jīng)元纖維的主要投射區(qū)域，推測RFRP與CRH存在著密切關系，RFRP可能通過調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺參與應激誘導的焦慮行為。

6 RFRP與應激反應

應激影響人類和動物生殖功能。許多研究顯示應激軸和生殖軸有密切關系。RFRP-3作為近年發(fā)現(xiàn)的中樞生殖軸的調節(jié)激素，其與應激的關系也引起研究者的關注。Elizabeth等人發(fā)現(xiàn)在雄性成年大鼠中無論急性束縛應激還是慢性束縛應激，都可以引起DMH區(qū)RFRP的表達的上調和生殖軸活動的抑制［48］。免疫組織化學結果顯示，大約有53%的RFRP細胞表達糖皮質激素受體，僅有13%的RFRP神經(jīng)元表達CRH的受體。同時腎上腺切除術可以消除應激引起的RFRP的表達升高。這些研究結果表明糖皮質激素可能是應激軸中主要參與生殖抑制的激素，可以直接作用于RFRP神經(jīng)元從而抑制生殖功能。另一個研究顯示足部電刺激增加了下丘腦背內側RFRP神經(jīng)元的Fos蛋白表達，提示電刺激應激可以激活生殖激素RFRP神經(jīng)元［44］。而給予腦室注射RFRP-1或RFRP-3可以引起血漿促腎上腺激素和催產素的增加。由于RFRP神經(jīng)元纖維投射到PVN，RFRP受體也存在與這個區(qū)域，提示RFRP神經(jīng)元可以激活PVN區(qū)的CRH神經(jīng)元。

綜上，哺乳動物的促性腺激素抑制激素(RFRP)及其受體主要分布在下丘腦，RFRP和GnRH共同參與哺乳動物生殖軸功能的調節(jié)。作為大腦的神經(jīng)肽，越來越多的研究顯示RFRP參與了動物的攝食、焦慮以及應激反應等行為，并起重要的調節(jié)作用。下丘腦PVN區(qū)和DMH區(qū)的促性腺激素抑制激素的網(wǎng)絡研究將會揭示哺乳動物神經(jīng)內分泌調節(jié)的核心機制，而GnRH和RFRP的相互調控機制將為動物行為神經(jīng)內分泌學開拓新的研究領域。

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