秦艽抗大鼠高尿酸血癥作用機制研究

劉穎 鄭立運 崔立然

秦艽在臨床上用于治療風濕性關節(jié)炎、風寒引起的周身疼痛等，通常具有良好的效果[1]。高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂引起的尿酸生成過多和（或）尿酸排泄減少的一組代謝性疾病。據(jù)統(tǒng)計，高尿酸血癥在人群中的發(fā)病率男性高達25.8%，女性為15%[2]，其不僅可以引起痛風性關節(jié)炎，而且是心血管疾病和腎臟疾病進展的獨立危險因素[3-6]，因此，維持穩(wěn)定的血尿酸水平對人類的健康有著重要的意義。目前，臨床上治療痛風的藥物主要有抑制尿酸生成的別嘌呤醇和促尿酸排泄的丙磺舒、苯溴馬隆等，由于這些藥物副作用大，使其應用受到限制。因此，借助中醫(yī)理論開發(fā)一種藥效穩(wěn)定、副作用小的天然藥物來解決這一難題具有一定的研究價值。傳統(tǒng)中醫(yī)將痛風列入痹癥的范疇，秦艽屬于龍膽科多年生草本植物，其用藥部位為根，現(xiàn)代藥理證明其具有非常好的降尿酸效果。

目前，降低血尿酸主要通過抑制尿酸生成和促進尿酸排泄這兩個途徑來實現(xiàn)的，腎臟是排泄尿酸的主要器官，其中OAT1、OAT3、URAT1這三種轉運蛋白在調(diào)控尿酸水平方面有著重要的意義。本研究就其是否能夠促進尿酸排泄為切入點，使用免疫組化和Western blotting方法，通過檢測以上三種蛋白表達水平來探討秦艽降血尿酸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠[7]，雄性，體重180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk（京2007-0001）。

1.2 實驗試劑 腺嘌呤（美國Sigma公司）、尿酸試劑盒（南京建成生物科技有限公司）、苯溴馬龍（宜昌長江藥業(yè)有限公

司）、DAB試劑盒（北京中山金橋生物技術有限公司），蘇木素、兔源抗OAT1多克隆抗體、兔源抗OAT3多克隆抗體、兔源抗URAT1多克隆抗體和HRP-羊抗兔IgG都購自北京博奧森生物技術有限公司，脫脂奶粉購自博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗器材 切片機（德國萊卡）、YDS-47-127液氮生物容器（成都全鳳液氮容器有限公司），染色缸、孵育盒、硝酸纖維素膜（NC膜）購自Amersham公司，轉膜濾紙購自Whatman公司。

1.4 方法

1.4.1 藥液配制 苯溴馬龍：根據(jù)大鼠與成人藥物劑量換算公式，成人（假設體重為70 kg）每日服用100 mg的劑量相當于大鼠每日服用9.0 mg/kg量。將藥片壓碎，加滅菌熱蒸餾水溶解、混勻，配成9.0 mg/ml濃度的混懸液。（1）腺嘌呤：用滅菌熱蒸餾水配成溶液，按照100 mg/（kg·d）的劑量灌胃。（2）乙胺丁醇：用滅菌熱蒸餾水配成溶液，按照250 mg/（kg·d）的劑量灌胃。（3）秦艽提取物：取秦艽藥材，加50%乙醇回流提取三次，每次1.5 h，合并濾液，濃縮至藥物濃度為1 g/ml。

1.4.2 對大鼠血尿酸的影響 取Wistar大鼠40只，隨機分為四組：空白組、模型組、給藥組，陽性組，每組10只，適應性飼養(yǎng)一周后，空白組ig.生理鹽水，模型組大鼠ig/d.給予腺嘌呤和乙胺丁醇，給藥組大鼠ig/d.給予腺嘌呤和乙胺丁醇后灌胃秦艽提取物，陽性對照組大鼠每日ig.給予腺嘌呤和乙胺丁醇后灌以苯溴馬龍，于實驗第7天，灌胃1 h后，各組動物摘眼球取血，血液經(jīng)4000 r/min離心25 min，取上清液，測定血清尿酸值。

1.4.3 對大鼠24 h總尿量和尿酸排泄量影響 大鼠分組及給藥同上，于末次給藥1 h后，采用代謝籠收集大鼠24 h內(nèi)尿液，采用全自動生化分析儀檢測尿酸濃度，計算24 h尿酸總排泄量。

1.4.4 免疫組化 取Wistar大鼠15只，適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為三組，空白組、給藥組及模型組，給藥方法同上，于末次給藥后1 h，將大鼠麻醉，取腎臟，保存在4%甲醛固定液中24 h。采用免疫組化方法，按照相應抗體說明書檢測腎臟組織的尿酸轉運相關蛋白OAT1、OAT3和URAT1的表達，觀察秦艽對尿酸轉運相關蛋白的影響。

1.4.5 Western blotting取Wistar大鼠15只，分組及給藥方法同上，末次給藥1 h后，大鼠麻醉，取其右腎，縱向切開分為兩部分，迅速置于液氮中，冷凍后，保存于-70 ℃低溫冰箱中。取200 μg組織經(jīng)研磨粉碎，加入1000 μl新鮮配制、冷蛋白裂解液。裂解液經(jīng)4 ℃、14000 r/min離心10 min，取上清液并測定蛋白濃度。取40 μg蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，置于SDS，電轉移到NC膜，用1%脫脂奶粉封閉。用稀釋度1：1000相應的多克隆抗體于4 ℃過夜，加入相應的二抗室溫下溫育60 min?？贵w檢查按試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 秦艽對大鼠血尿酸、24 h尿量及尿酸排泄量的影響 灌胃腺嘌呤和乙胺丁醇成功復制了大鼠高尿酸血癥模型，秦艽能夠降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸，增加大鼠24 h尿量和尿酸的排泄量。見表1。

表1 大鼠24 h尿量及尿酸排泄量

2.2 秦艽對大鼠轉運蛋白的影響

2.2.1 免疫組化圖像分析與處理 免疫組化切片在光學顯微鏡下觀察，對URAT1、OAT1和OAT3在腎組織表達量的分析采用以下方法：在400倍視野下每張切片隨機選取互不重疊的10個視野，用Image-proPlusversion 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國MdeiaCybemeties公司）進行分析。結果發(fā)現(xiàn)模型組OATI和OAT3的蛋白表達明顯低于空白組，秦艽給藥組的OATI和OAT3的蛋白表達明顯高于模型組，模型組的URAT1蛋白表達明顯高于空白組，秦艽給藥組的URAT1的蛋白表達明顯低于模型組。

2.2.2 Western-blotting檢測結果 用目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值所得數(shù)據(jù)，免疫組化和Western blotting實驗結果表明，秦艽能夠上調(diào)高尿酸血癥大鼠OAT1 和OAT3蛋白的表達，降低高尿酸血癥大鼠URAT1的蛋白表達。見表2。

表2 OAT1、OAT3和URAT1蛋白表達灰度分析

3 討論

模型的復制方法、陽性藥的選擇要基于實驗目的而定，本實驗的目的是為了探討秦艽是否通過促進尿酸排泄而達到降尿酸的作用，由于乙胺丁醇能抑制尿酸的排泄產(chǎn)生高尿酸血癥，因此，本實驗所采用的模型復制方法為傳統(tǒng)的腺嘌呤加乙胺丁醇灌胃法，選擇能夠促進尿酸排泄的苯溴馬龍作為本實驗的陽性藥。

近年來，已從分子水平證實4種蛋白質(zhì)參與了尿酸鹽在腎小管的轉運，其中OATI和OAT3表達在腎小管上皮細胞基底側膜，負責將尿酸從管周毛細血管轉運到腎小管上皮細胞內(nèi)，完成尿酸分泌的第一步；OAT4命名為人尿酸鹽陰離子交換器（URAT1），URATI表達在腎小管上皮細胞刷狀緣，負責尿酸的重吸收[8]。這些轉運蛋白對尿酸濃度的調(diào)控作用，使其成為高尿酸血癥藥物治療的重要靶點，本實驗通過免疫組化和Western blotting方法發(fā)現(xiàn)，秦艽的有效部位能夠上調(diào)高尿酸血癥大鼠OAT1和OAT3蛋白的表達，降低高尿酸血癥大鼠URAT1的蛋白表達。這些可能是其發(fā)揮抗高尿酸癥的作用的重要機制之一，這為中藥抗痛風疾病提供了新的科研思路和方法。

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