阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接的影響

張秀梅，于曉玲，申玉超，駱振華（.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，遼寧錦州00；.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧錦州 00）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是常見的心血管疾病之一，常引起重要臟器的嚴(yán)重病變（如心肌梗死和腦梗死），但其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。近年來(lái)，細(xì)胞間縫隙連接與AS形成的關(guān)系備受研究者的關(guān)注。組成縫隙連接的蛋白亞單位稱為連接蛋白（Connexins），現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有20種以上的Connexins亞型，其中內(nèi)皮細(xì)胞表面有 Connexin 43、Connexin 37、Connexin 40 的表達(dá)[1]。Connexin 43、Connexin 40在改變內(nèi)皮細(xì)胞功能和AS的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用。另一方面，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）在AS的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積是AS的始動(dòng)因素，ox-LDL可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[2-3]。研究表明，他汀類藥物除了調(diào)脂作用外，可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗炎、抗氧化、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用，但確切途徑尚不清楚。本研究觀察阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的Connexin 43、Connexin 40表達(dá)的影響，探討其改善AS可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo forma公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；超速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（北京恒大圖像視覺有限公司）；Power Pac3000電泳儀、EC-120電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

阿托伐他汀原料藥（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：PZ0001，純度：≥98%）；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶、磷酸緩沖液（PBS）（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司，批號(hào)：YB-002，規(guī)格：2.0 mg/ml）；兔抗人 Connexin 43（批號(hào)：bs-0651R）、Connexin 40（批號(hào)：bs-4087R）多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；庚醇、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鼠抗兔的二抗、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、山羊血清（封閉液）、1×TBST洗膜液、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液、Connexin 43蛋白二抗B液、Connexin 43蛋白二抗C液、Griess試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心配制。

1.3 細(xì)胞株

HUVECs購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

取HUVECs常規(guī)傳代，傳至5代后接種于已放入蓋玻片的6孔板培養(yǎng)液中，待HUVECs長(zhǎng)至蓋玻片的約80%滿時(shí)換液。將其分為對(duì)照組、ox-LDL組、陽(yáng)性對(duì)照組和阿托伐他汀組，對(duì)照組給予含10%胎牛血清的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；其余組分別先在培養(yǎng)液、加入50μmol/L庚醇的培養(yǎng)液、加入不同劑量（0.01、0.1、1.0、10 μmol/L）阿托伐他汀的培養(yǎng)液中處理30 min，再分別加入50 mg/L的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2 硝酸還原酶法檢測(cè)一氧化氮（NO）濃度

取傳代HUVECs，檢測(cè)前24 h各組換為無(wú)血清培養(yǎng)基，之后按組培養(yǎng)收集細(xì)胞培養(yǎng)液。每組取樣500μl置于含有20μmol/L亞硝酸鈉的試管中，各管分別加入Griess試劑1.2 ml，振蕩混勻后，靜置10 min，4000 r/min離心10 min，取上清0.8 ml，加入顯色劑0.4 ml，混勻放置15 min，用可見分光光度儀檢測(cè)550 nm波長(zhǎng)處NO的吸光度（A值），計(jì)算NO濃度。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Connexin 43蛋白定位表達(dá)

用冰PBS沖洗各組6孔板3次，每次各4 min，4%多聚甲醛固定30～60 min，以30%H2O2-純甲醇（1∶9，V/V）混合液室溫浸泡30 min，PBS清洗標(biāo)本3次，每次各4 min；加入封閉液于37℃下封閉30 min，加入兔抗人Connexin 43多克隆抗體孵育（用PBS配置，滴度1∶600），4℃下過(guò)夜，PBS清洗標(biāo)本3次，每次各4 min；二抗B液于37℃下孵育30 min，PBS清洗標(biāo)本3次，每次各4 min，加二抗C液于37℃下孵育30 min，PBS清洗標(biāo)本3次，每次各4 min，DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約3～10 min，蒸餾水洗2次，每次各2 min，蘇木素復(fù)染15 min后以自來(lái)水沖洗，制成標(biāo)本。用倒置顯微鏡觀察標(biāo)本中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周圍Connexin 43蛋白染色。

2.4 蛋白印跡法檢測(cè)Connexin 43、Connexin 40蛋白定量表達(dá)

收集每組細(xì)胞于EP管內(nèi)，超聲裂解，再4℃、1000 r/min離心2 min，用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)上清蛋白濃度。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度上樣，以80 V電壓常規(guī)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用封閉液4℃封閉過(guò)夜。將稀釋的兔抗人Connexin 43、Connexin 40多克隆抗體（1∶400）加入硝酸纖維膜，置于小封口塑料袋內(nèi)37℃孵育2 h，1×TBST洗膜液洗膜，加入稀釋HRP標(biāo)記的鼠抗兔的二抗（1∶4500），37 ℃孵育1 h，1×TBST洗膜液洗膜，將膜置于含5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽33μl/氯化硝基四氮唑藍(lán)66μl的染色液10 ml中，于室溫下輕輕搖晃，使蛋白條帶逐漸顯影、定影，膠片洗滌干燥。對(duì)圖片各電泳條帶亮度進(jìn)行掃描，并以β-actin為對(duì)照，用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 各組HUVECs中NO濃度

與對(duì)照組比較，ox-LDL組、陽(yáng)性對(duì)照組和阿托伐他汀組HUVECs上清液中NO濃度顯著減少（P＜0.01）。與ox-LDL組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和阿托伐他汀組中NO濃度均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），其中阿托伐他汀組呈劑量依賴性增加。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，10μmol/L阿托伐他汀組中NO濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組HUVECs中NO濃度比較見表1。

表1 各組HUVECs中NO濃度和Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）Tab 1 Comparison of NO concentration，protein expression of Connexin 43 and Connexin 40 in HUVECs among those groups（±s，n＝6）

表1 各組HUVECs中NO濃度和Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）Tab 1 Comparison of NO concentration，protein expression of Connexin 43 and Connexin 40 in HUVECs among those groups（±s，n＝6）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與ox-LDL組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較：ΔP＞0.05vs.control group：＊P＜0.01；vs.ox-LDL group：#P＜0.05，##P＜0.01；vs.positive control group：ΔP＞0.05

組別對(duì)照組ox-LDL組陽(yáng)性對(duì)照組阿托伐他汀0.01 μmol/L組阿托伐他汀0.1 μmol/L組阿托伐他汀1 μmol/L組阿托伐他汀10 μmol/L組NO，μmol/L 53.23±1.08616.82±0.970＊46.30±0.895＊##18.25±0.88＊#28.08±0.825＊##37.86±0.795＊##46.11±0.878＊##ΔConnexin 43，%0.406±0.0341.052±0.025＊0.778±0.080＊#1.010±0.041＊#0.92±0.035＊##0.862±0.056＊##0.791±0.048＊##ΔConnexin 40，%0.385±0.0280.917±0.04＊0.695±0.075＊#0.878±0.018＊#0.801±0.021＊##0.764±0.021＊##0.698±0.037＊##Δ

3.2 各組HUVECs中Connexin 43蛋白定位表達(dá)

對(duì)照組細(xì)胞中見較弱的Connexin 43蛋白染色，即淡黃色。與對(duì)照組比較，10 μmol/L阿托伐他汀組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)均無(wú)明顯差異。ox-LDL組細(xì)胞皺縮、紊亂，細(xì)胞中可見大量的棕褐色顆粒、濃染。0.01、0.1、1.0 μmol/L阿托伐他汀組可見細(xì)胞皺縮、中等量的棕褐色顆粒，其顯微鏡圖略，其余各組HUVECs中Connexin 43蛋白定位表達(dá)顯微鏡圖見圖1。

3.3 各組HUVECs中Connexin 43、Connexin 40蛋白定量表達(dá)

圖1 各組HUVECs中Connexin 43蛋白定位表達(dá)顯微鏡圖（×100）Fig 1 Micrograph of location expression of Connexin 43 in HUVECs among those group（s×100）

與對(duì)照組比較，ox-LDL組、陽(yáng)性對(duì)照組和阿托伐他汀組細(xì)胞中Connexin 43、Connexin 40蛋白定量表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。與ox-LDL組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和阿托伐他汀組細(xì)胞中Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)均明顯減少（P＜0.01），其中阿托伐他汀組呈劑量依賴性減少。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，10μmol/L阿托伐他汀組細(xì)胞中Connexin 43、Connexin 40蛋白定量表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組HUVECs中Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)見表1，電泳圖見圖2。

圖2 各組HUVECs中Connexin 43、Connexin 40蛋白定量表達(dá)電泳圖Fig 2 Electrophoresis of quantitative expression of Connexin 43 and Connexin 40 in HUVECs among those groups

4 討論

眾所周知，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能改變?cè)贏S的形成過(guò)程中起著非常重要的作用，而ox-LDL在AS的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，ox-LDL可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞黏附于內(nèi)皮并向內(nèi)皮下趨化和促進(jìn)血小板黏附、聚集、血栓形成等多種途徑促使AS的發(fā)生發(fā)展[4]。通過(guò)Connexin 43基因半敲除的LDL受體基因缺陷小鼠與LDL受體基因缺陷的、帶有正常Connexin 43基因的小鼠相比，其Connexin 43蛋白表達(dá)減少；喂養(yǎng)高膽固醇飼料14周后其胸腹主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣病變后，其粥樣斑塊中含更少的炎癥細(xì)胞和更多的膠原蛋白、更厚的平滑肌纖維帽，提示Connexin 43不僅參與白細(xì)胞聚集，而且在AS斑塊形成中起重要作用[5]。研究證實(shí)，在人類冠狀A(yù)S的早期，Connexin 43、Connexin 40造成內(nèi)膜的增厚，增加白細(xì)胞黏附，加速AS的進(jìn)展[6]。對(duì)內(nèi)皮功能紊亂進(jìn)行藥物干預(yù)治療，已成為心血管領(lǐng)域一個(gè)全新的發(fā)展趨勢(shì)。他汀類藥物在沒(méi)有產(chǎn)生任何降脂作用的情況下，能保護(hù)冠狀動(dòng)脈的內(nèi)皮功能，尤其在心肌對(duì)血液的需求增加時(shí)，能保持正常的冠狀動(dòng)脈灌注和冠狀動(dòng)脈微血管的完整性[7]。在兔AS斑塊中，Connexin 43、Connexin 40表達(dá)明顯上調(diào)，而通過(guò)他汀類藥物治療者的粥樣硬化斑塊中Connexin 43、Connexin 40的表達(dá)明顯受抑制[8]。筆者通過(guò)觀察阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中Connexin 43、Connexin 40表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過(guò)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中Connexin 43、Connexin 40蛋白的增加，發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮功能，從而改善AS。

內(nèi)源性一氧化氮合酶生成的NO能夠預(yù)防AS，并對(duì)不同階段的AS的病理形成均有改善和逆轉(zhuǎn)作用。與對(duì)照組比較，其余各組中NO濃度均明顯減少；與ox-LDL組比較，阿托伐他汀組中NO濃度呈劑量依賴性增加；10μmol/L阿托伐他汀組與陽(yáng)性對(duì)照組中NO濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明阿托伐他汀可通過(guò)增加NO濃度，進(jìn)一步改善內(nèi)皮功能；且阿托伐他汀劑量越大，增加的NO濃度越多，對(duì)內(nèi)皮功能改善可能越明顯。但10μmol/L阿托伐他汀是否為最佳劑量尚需進(jìn)一步證實(shí)。對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見較弱的Connexin 43蛋白陽(yáng)性染色，呈淡黃色；ox-LDL組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕褐色顆粒；0.01、0.1、1.0μmol/L阿托伐他汀組細(xì)胞可看到細(xì)胞皺縮、中等量的棕褐色顆粒；而10μmol/L阿托伐他汀組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)僅可見少量棕褐色顆粒，說(shuō)明阿托伐他汀減少了受損HUVECs中Connexin 43的表達(dá)。與ox-LDL組比較，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞的Connexin 43、Connexin 40蛋白顯著減少；阿托伐他汀組細(xì)胞中Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)呈劑量依賴性減少；10μmol/L阿托伐他汀組與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上說(shuō)明，阿托伐他汀可通過(guò)增加細(xì)胞中NO濃度和減少Connexin 43、Connexin 40蛋白的表達(dá)來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞間的縫隙連接功能，為他汀類藥物抗AS作用提供了新的靶點(diǎn)。

綜上所述，阿托伐他汀可通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞間Connexin 43、Connexin 40蛋白的表達(dá)，減弱ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害，從而抑制AS的發(fā)生發(fā)展。目前研究[9]表明，人類Connexin 43基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控涉及轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3、Nkx2-5、Tbx5、GATA4等，其中Sp1、Sp3、NKX2-5和GATA4的激活是Connexin 43、Connexin 40的基因啟動(dòng)子，而Tbx5能抑制Nkx2-5/GATA4調(diào)節(jié)Connexin 43、Connexin 40基因啟動(dòng)子的激活。內(nèi)皮細(xì)胞間縫隙連接功能改變的研究是AS治療的新領(lǐng)域，這為改善冠心病患者的治療與預(yù)后提供了一個(gè)新的理論依據(jù)。但對(duì)于阿托伐他汀影響Connexin 43、Connexin 40蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。

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